Структура Холлидейного соединения: особенности и функции.

Введение

Разветвленная структура нуклеиновой кислоты

Стыковочный узел Холлидея – это разветвленная структура нуклеиновой кислоты, содержащая четыре соединенные двухцепочечные ветви. Эти ветви могут принимать одну из нескольких конформаций в зависимости от концентрации буферной соли и последовательности нуклеотидных оснований, расположенных вблизи узла. Структура названа в честь Робина Холлидея, молекулярного биолога, который предположил ее существование в 1964 году. В биологии стыковочные узлы Холлидея являются ключевым промежуточным звеном во многих типах генетической рекомбинации, а также при восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК. Эти узлы обычно имеют симметричную последовательность и, следовательно, подвижны, то есть четыре отдельные ветви могут скользить через узел по определенной схеме, в значительной степени сохраняя спаривание оснований. Кроме того, четырехветвевые узлы, подобные стыковочным узлам Холлидея, встречаются в некоторых функциональных молекулах РНК. Неподвижные стыковочные узлы Холлидея с асимметричными последовательностями, фиксирующими цепи в определенном положении, были искусственно созданы учеными для изучения их структуры в качестве модели природных стыковочных узлов Холлидея. Эти узлы также впоследствии нашли применение в качестве основных структурных элементов в ДНК-нанотехнологиях, где несколько стыковочных узлов Холлидея могут быть объединены в специально разработанные геометрические структуры, обеспечивающие молекулам высокую степень структурной жесткости.

Структура

Соединения Холлидея могут существовать в различных конформационных изомерах с различными вариантами коаксиальной укладки между четырьмя двойными спиральными плечами. Коаксиальная укладка – это тенденция тупых концов нуклеиновых кислот связываться друг с другом за счет взаимодействий между выступающими основаниями. Существует три возможных конформера: раскладная (или открытая X) форма и две сложенные формы. Раскладная форма преобладает в отсутствие двухвалентных катионов, таких как Mg2+, из-за электростатического отталкивания между отрицательно заряженными цепями. В присутствии не менее 0,1 мМ Mg2+ электростатическое отталкивание нейтрализуется, и преобладают сложенные структуры. По состоянию на 2000 год, не было достоверно известно, является ли электростатическая защита результатом специфического связывания катионов с перекрестком или наличия диффузного скопления ионов в растворе. Раскладная форма представляет собой почти плоскую, расширенную конформацию, близкую к квадратной. С другой стороны, сложенные конформеры имеют два непрерывных домена двойной спирали, разделенных углом около 60° в правостороннем направлении. Две из четырех цепей остаются примерно спиральными, оставаясь в пределах каждого из двух доменов двойной спирали, в то время как две другие пересекают два домена антипараллельным образом. Хотя четырехрукие перекрестки также встречаются в функциональных молекулах РНК, таких как сплайсосомная РНК U1 и рибозим шнуркового типа вируса кольцевой пятнистости табака, они обычно содержат неспаренные нуклеотиды между спаренными доменами двойной спирали и, следовательно, не строго принимают структуру Холлидея. Многие белки способны распознавать или искажать структуру перекрестка Холлидея. Один из таких классов включает ферменты, разрешающие перекрестки, которые расщепляют перекрестки, иногда последовательно-специфичным образом. Эти белки искажают структуру перекрестка различными способами, часто втягивая перекресток в раскладную конформацию, разрывая центральные пары оснований и/или изменяя углы между четырьмя плечами. Другие классы – это белки миграции ветвей, которые увеличивают скорость обмена на порядки величины, и сайт-специфичные рекомбиназы. В случае разрыва двойной нити 3'-конец деградирует, а более длинный 5'-конец вторгается в смежную сестринскую хроматиду, образуя пузырь репликации. Когда этот пузырь приближается к поврежденной ДНК, более длинная 5'-антисмысловая цепь снова вторгается в смысловую цепь этой части ДНК, транскрибируя вторую копию. Когда репликация завершается, оба конца рекомбинируют, образуя два соединения Холлидея, которые затем расщепляются белками различными способами. Анимацию этого процесса можно посмотреть здесь. Разрывы двойной нити ДНК у бактерий восстанавливаются путем гомологичной рекомбинации, опосредованной путем RecBCD. Считается, что разрывы, возникающие только на одной из двух цепей ДНК, известные как одноцепочечные пробелы, восстанавливаются путем RecF. Как путь RecBCD, так и путь RecF включают серию реакций, известных как миграция ветвей, в которой отдельные цепи ДНК обмениваются между двумя перекрещенными молекулами двухцепочечной ДНК, и разрешение, в котором эти две перекрещенные молекулы ДНК разрезаются и восстанавливаются в их нормальное двухцепочечное состояние. Гомологичная рекомбинация происходит в нескольких группах вирусов. В ДНК-вирусах, таких как вирус герпеса, рекомбинация происходит посредством механизма разрыва и воссоединения, как у бактерий и эукариот. У бактерий миграция ветвей облегчается комплексом RuvABC или белком RecG, молекулярными двигателями, которые используют энергию гидролиза АТФ для перемещения перекрестка. Затем перекресток должен быть разрешен на два отдельных дуплекса, восстанавливая либо родительскую конфигурацию, либо перекрестную конфигурацию. Разрешение может происходить как в горизонтальном, так и в вертикальном направлении во время гомологичной рекомбинации, давая продукты заплатки (если в одной ориентации во время восстановления разрыва двойной нити) или продукты сшивания (если в разных ориентациях во время восстановления разрыва двойной нити). RuvA и RuvB являются белками миграции ветвей, а RuvC – ферментом, разрешающим перекрестки.

Holliday junctions may exist in a variety of conformational isomers with different patterns of coaxial stacking between the four double helical arms. Coaxial stacking is the tendency of nucleic acid blunt ends to bind to each other, by interactions between the exposed bases. There are three possible conformers: an unstacked (or open X) form and two stacked forms. The unstacked form dominates in the absence of divalent cations such as Mg2+, because of electrostatic repulsion between the negatively charged backbones of the strands. In the presence of at least about 0.1 mM Mg2+, the electrostatic repulsion is counteracted and the stacked structures predominate. As of 2000, it was not known with certainty whether the electrostatic shielding was the result of site specific binding of cations to the junction, or the presence of a diffuse collection of the ions in solution. The unstacked form is a nearly square planar, extended conformation. On the other hand, the stacked conformers have two continuous double helical domains separated by an angle of about 60° in a right handed direction. Two of the four strands stay roughly helical, remaining within each of the two double helical domains, while the other two cross between the two domains in an antiparallel fashion. While four arm junctions also appear in functional RNA molecules, such as U1 spliceosomal RNA and the hairpin ribozyme of the tobacco ringspot virus, these usually contain unpaired nucleotides in between the paired double helical domains, and thus do not strictly adopt the Holliday structure. Many proteins are able to recognize or distort the Holliday junction structure. One such class contains junction resolving enzymes that cleave the junctions, sometimes in a sequence specific fashion. Such proteins distort the structure of the junction in various ways, often pulling the junction into an unstacked conformation, breaking the central base pairs, and/or changing the angles between the four arms. Other classes are branch migration proteins that increase the exchange rate by orders of magnitude, and site specific recombinases. In the case of double strand breakage, the 3' end is degraded and the longer 5' end invades the contiguous sister chromatid, forming a replication bubble. As this bubble nears the broken DNA, the longer 5' antisense strand again invades the sense strand of this portion of DNA, transcribing a second copy. When replication ends, both tails are reconnected to form two Holliday Junctions, which are then cleaved in a variety of patterns by proteins. An animation of this process can be seen here. Double strand DNA breaks in bacteria are repaired by the RecBCD pathway of homologous recombination. Breaks that occur on only one of the two DNA strands, known as single strand gaps, are thought to be repaired by the RecF pathway. Both the RecBCD and RecF pathways include a series of reactions known as branch migration, in which single DNA strands are exchanged between two intercrossed molecules of duplex DNA, and resolution, in which those two intercrossed molecules of DNA are cut apart and restored to their normal double stranded state. Homologous recombination occurs in several groups of viruses. In DNA viruses such as herpesvirus, recombination occurs through a break and rejoin mechanism like in bacteria and eukaryotes. In bacteria, branch migration is facilitated by the RuvABC complex or RecG protein, molecular motors that use the energy of ATP hydrolysis to move the junction. The junction must then be resolved into two separate duplexes, restoring either the parental configuration or a crossed over configuration. Resolution can occur in either a horizontal or vertical fashion during homologous recombination, giving patch products (if in same orientation during double strand break repair) or splice products (if in different orientations during double strand break repair). RuvA and RuvB are branch migration proteins, while RuvC is a junction resolving enzyme.

Резолюция

В зарождающихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae соединения Холлидей могут разрешаться четырьмя различными путями, которые обеспечивают практически все разрешение соединений Холлидей in vivo. Путь, который обеспечивает большинство кроссоверов в зарождающихся дрожжах S. cerevisiae и, возможно, у млекопитающих, включает белки EXO1, гетеродимер MLH1-MLH3 (называемый MutL gamma) и SGS1 (ортолог геликазы синдрома Блума). Это эндонуклеаза, вызывающая разрывы одной цепи в суперспирализованной двухцепочечной ДНК. Гетеродимер MLH1-MLH3 способствует образованию кроссоверных рекомбинантов. В то время как другие три пути, включающие белки MUS81-MMS4, SLX1 и YEN1 соответственно, могут способствовать разрешению соединений Холлидей in vivo, отсутствие всех трех нуклеаз оказывает лишь умеренное влияние на образование кроссоверных продуктов. Двойные мутанты с делецией генов MLH3 (основной путь) и MMS4 (второстепенный путь) показали значительно сниженное кроссинговер по сравнению с диким типом (в 6–17 раз); однако жизнеспособность спор оставалась достаточно высокой (62%), а хромосомное расхождение в основном было функциональным. У простейшего Tetrahymena thermophila MUS81 является частью важного, если не преобладающего, кроссоверного пути. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae MSH4 и MSH5 специфически облегчают кроссинговер между гомологичными хромосомами во время мейоза. Тем не менее, этот мутант привел к появлению паттернов жизнеспособности спор, указывающих на то, что сегрегация не обменивающихся хромосом происходила эффективно. Таким образом, в S. cerevisiae правильная сегрегация, по-видимому, не полностью зависит от кроссинговера между гомологичными парами.

Использование в нанотехнологии ДНК

Нанотехнология ДНК – это проектирование и создание искусственных структур нуклеиновых кислот в качестве инженерных материалов для нанотехнологий, а не как носителей генетической информации в живых клетках. В этой области разветвленные структуры ДНК используются как фундаментальные компоненты для создания более сложных, рационально спроектированных структур. Соответственно, стыки Холлидея являются компонентами многих таких структур ДНК. Поскольку изолированные комплексы стыков Холлидея слишком гибкие для сборки в большие упорядоченные массивы, структурные мотивы с несколькими стыками Холлидея используются для создания жестких «плиток», которые затем могут собираться в более крупные «массивы». Наиболее распространенным таким мотивом является комплекс двойного кроссовера (DX), содержащий два стыка Холлидея в непосредственной близости друг от друга, что приводит к образованию жесткой структуры, способной к самосборке в более крупные массивы. Структура молекулы DX заставляет стыки Холлидея принимать конформацию, в которой двойные спиральные домены расположены непосредственно бок о бок, в отличие от их предпочтительного угла около 60°. Комплекс может быть спроектирован таким образом, чтобы зафиксировать стыки в параллельной или антипараллельной ориентации, но на практике антипараллельные варианты более стабильны, а параллельная версия используется редко. Были продемонстрированы типы плиток, сохраняющие нативный угол 60° стыка Холлидея. Один из таких массивов использует плитки, содержащие четыре стыка Холлидея в параллелограммном расположении. Эта структура позволила напрямую визуализировать угол стыка с помощью атомно-силовой микроскопии. Плитки из трех стыков Холлидея в треугольной форме использовались для создания периодических трехмерных массивов для применения в рентгеновской кристаллографии биомолекул. Эти структуры названы по аналогии со структурными единицами, основанными на принципе тенсегрити, который использует элементы, работающие как на растяжение, так и на сжатие, где новая цепь синтезируется непосредственно из фрагментов различных родительских цепей. В оригинальной модели Холлидея для гомологической рекомбинации одноцепочечные разрывы происходят в одной точке на одной цепи каждой родительской ДНК. Свободные концы каждой разорванной цепи затем мигрируют к другой спирали ДНК. Там вторгшиеся цепи соединяются со свободными концами, с которыми они сталкиваются, образуя стык Холлидея. По мере того как каждая кроссоверная цепь повторно аннелирует со своей исходной комплементарной цепью, она вытесняет исходную комплементарную цепь перед собой. Это приводит к миграции стыка Холлидея и образованию гетеродуплексных сегментов. В зависимости от того, какая цепь использовалась в качестве матрицы для восстановления другой, четыре клетки, полученные в результате мейоза, могут содержать три копии одного аллеля и только одну копию другого, вместо нормальных двух копий каждого, что является свойством, известным как конверсия генов. Первоначально генетики предполагали, что стык будет принимать параллельную, а не антипараллельную конформацию, поскольку это обеспечило бы более тесное выравнивание гомологичных дуплексов. В то время было известно несколько естественных разветвленных структур ДНК, включая репликационную вилку ДНК и подвижный стык Холлидея, но Симан пришел к выводу, что неподвижные стыки нуклеиновых кислот могут быть созданы путем правильного проектирования последовательностей цепей для устранения симметрии в собранной молекуле, и что эти неподвижные стыки в принципе могут быть объединены в жесткие кристаллические решетки. Первая теоретическая работа, предлагающая эту схему, была опубликована в 1982 году, а первая экспериментальная демонстрация неподвижного стыка ДНК – в следующем году. Симан разработал более жесткий мотив двойного кроссовера (DX), подходящий для формирования двухмерных решеток, который был продемонстрирован им и Эриком Винфри в 1998 году. Синтез трехмерной решетки был наконец опубликован Симаном в 2009 году, почти через тридцать лет после того, как он поставил перед собой эту задачу.

DNA nanotechnology is the design and manufacture of artificial nucleic acid structures as engineering materials for nanotechnology rather than as the carriers of genetic information in living cells. The field uses branched DNA structures as fundamental components to create more complex, rationally designed structures. Holliday junctions are thus components of many such DNA structures. As isolated Holliday junction complexes are too flexible to assemble into large ordered arrays, structural motifs with multiple Holliday junctions are used to create rigid "tiles" that can then assemble into larger "arrays". The most common such motif is the double crossover (DX) complex, which contains two Holliday junctions in close proximity to each other, resulting in a rigid structure that can self assemble into larger arrays. The structure of the DX molecule forces the Holliday junctions to adopt a conformation with the double helical domains directly side by side, in contrast to their preferred angle of about 60°. The complex can be designed to force the junctions into either a parallel or antiparallel orientation, but in practice the antiparallel variety are more well behaved, and the parallel version is rarely used. Some tile types that retain the Holliday junction's native 60° angle have been demonstrated. One such array uses tiles containing four Holliday junctions in a parallelogram arrangement. This structure had the benefit of allowing the junction angle to be directly visualized via atomic force microscopy. Tiles of three Holliday junctions in a triangular fashion have been used to make periodic three dimensional arrays for use in X ray crystallography of biomolecules. These structures are named for their similarity to structural units based on the principle of tensegrity, which utilizes members both in tension and compression. where the new strand is synthesized directly from parts of the different parent strands. In the original Holliday model for homologous recombination, single strand breaks occur at the same point on one strand of each parental DNA. Free ends of each broken strand then migrate across to the other DNA helix. There, the invading strands are joined to the free ends they encounter, resulting in the Holliday junction. As each crossover strand reanneals to its original partner strand, it displaces the original complementary strand ahead of it. This causes the Holliday junction to migrate, creating the heteroduplex segments. Depending on which strand was used as a template to repair the other, the four cells resulting from meiosis might end up with three copies of one allele and only one of the other, instead of the normal two of each, a property known as gene conversion. Initially, geneticists assumed that the junction would adopt a parallel rather than antiparallel conformation, because that would place the homologous duplexes in closer alignment to each other. A number of natural branched DNA structures were known at the time, including the DNA replication fork and the mobile Holliday junction, but Seeman's insight was that immobile nucleic acid junctions could be created by properly designing the strand sequences to remove symmetry in the assembled molecule, and that these immobile junctions could in principle be combined into rigid crystalline lattices. The first theoretical paper proposing this scheme was published in 1982, and the first experimental demonstration of an immobile DNA junction was published the following year. Seeman developed the more rigid double crossover (DX) motif, suitable for forming two dimensional lattices, demonstrated in 1998 by him and Erik Winfree. The synthesis of a three dimensional lattice was finally published by Seeman in 2009, nearly thirty years after he had set out to achieve it.