Введение

Биомедицинская техника Двойная иммунодиффузия ухтерлони (также известная как пассивная двойная иммунодиффузия) - это иммунологическая техника, используемая для обнаружения, идентификации и количественной оценки антител и антигенов, таких как иммуноглобулины и экстрагируемые ядерные антигены. Этот метод назван в честь Оряна Оухтерлони, шведского врача, который в 1948 году разработал тест для оценки выработки дифтерийных токсинов из изолированных бактерий.

Процедура

Гелевую пластину разрезают, чтобы сформировать ряд отверстий ("колодцы") в геле агара или агарозы. Экстракт образца, представляющий интерес (например, человеческие клетки, полученные из ткани миндалины), помещают в одну колодец, сыворотки или очищенные антитела помещают в другую колодец, а пластинку оставляют на 48 часов для развития. В течение этого времени антигены в экстракте образца и антитела рассеиваются из своих соответствующих скважин. Там, где встречаются два фронта диффузии, если какие-либо антитела распознают какие-либо антигены, они связываются с антигенами и образуют иммунный комплекс. Иммунный комплекс осаждается в геле, образуя тонкую белую линию (линию преципитина), которая является визуальной подписью распознавания антигена. Метод может проводиться параллельно с использованием нескольких скважин, заполненных различными антигенными смесями, и нескольких скважин с различными антителами или смесями антитела, и реактивность антигенных антитела может быть определена путем наблюдения между какими скважинами наблюдается осадок. При использовании более одного скважины существует множество возможных исходов, основанных на реактивности выбранного антигена и антитела. Зона линий эквивалентности может давать полную идентичность (т.е. непрерывную линию), частичную идентичность (т.е. непрерывную линию с шпором на одном конце) или неидентичность (т.е. две линии полностью пересекаются). Чувствительность анализа можно увеличить с помощью красителя, такого как блестящий синий цвет Кумасси, это делается путем повторного окрашивания и дезагрегации анализа до тех пор, пока линии осадочного вещества не достигнут максимальной видимости.

Теория

Осаждение происходит с большинством антигенов, потому что антиген является многовалентным (т. е. имеет несколько антигенных детерминантов на молекулу, к которой могут связываться антитела). Антитела имеют по крайней мере два места связывания антигена (а в случае иммуноглобулина М существует мультимерический комплекс с до 10 местами связывания антигена), таким образом образуются большие агрегаты или гелеподобные решетки антигена и антитела. Экспериментально увеличивается количество антигена, добавляемого к постоянному количеству антитела в растворе. Вначале при низкой концентрации антигена все антитела содержится в осадочном веществе. Это называется зоной избытка антител (т. е. феномен прозоны). По мере добавления большего количества антигена количество осажденного белка увеличивается, пока молекулы антигена/антитела не достигнут оптимального соотношения. Это зоны эквивалентности или точки эквивалентности. Когда количество антигена в растворе превышает количество антитела, количество осаждения уменьшается. Это зона избытка антигена.