Вестерн-блот: принцип, применение и возможности анализа белков

Вестерн-блот (иммуноблоттинг) – анализ белков в биологии. Обнаружение, визуализация и количественная оценка белков с помощью антител. Методика и применение.

13 мин чтения

100%

Источник: Western blot — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Аналитический метод, используемый в молекулярной биологии

Вестерн-блот (иногда называемый белковым иммуноблотом), или вестерн-блотинг, – широко используемый аналитический метод в молекулярной биологии и иммуногенетике для обнаружения специфических белков в образце тканевого гомогената или экстракта. Помимо обнаружения белков, этот метод также используется для визуализации, различения и количественной оценки различных белков в сложном белковом составе. Техника вестерн-блота использует три этапа для достижения своей задачи – разделения конкретного белка из комплекса: разделение по размеру, перенос белка на твердую подложку и маркировка целевого белка с использованием первичных и вторичных антител для визуализации. Добавляется вторичное антитело, которое распознает и связывается с первичным антителом. Вторичное антитело визуализируется различными методами, такими как окрашивание, иммунофлуоресценция и радиоактивность, что позволяет косвенно обнаружить специфический целевой белок. Подтверждающий тест на ВИЧ использует вестерн-блот для выявления анти-ВИЧ антител в образце сыворотки крови человека. Белки из известных ВИЧ-инфицированных клеток разделяются и переносятся на мембрану, как описано выше. Затем сыворотка, подлежащая исследованию, добавляется на этапе инкубации с первичными антителами; несвязавшиеся антитела отмываются, и добавляются вторичные антитела к человеческим антителам, конъюгированные с энзимным сигналом. Окрашенные полосы указывают на белки, к которым сыворотка пациента содержит антитела. Вестерн-блот также используется в качестве окончательного теста при варианте болезни Крейтцфельдта-Якоба, типе прионного заболевания, связанного с употреблением в пищу зараженной говядины от крупного рогатого скота с губчатой энцефалопатией (БСЭ, обычно называемой «коровьим бешенством»). Другое применение – диагностика туляремии. Оценка способности вестерн-блота обнаруживать антитела к *F. tularensis* показала, что его чувствительность составляет почти 100%, а специфичность – 99,6%. Некоторые тесты на болезнь Лайма используют вестерн-блотинг. Вестерн-блот также может использоваться в качестве подтверждающего теста при инфекции гепатитом B и инфекции HSV 2 (герпес типа 2). В ветеринарной медицине вестерн-блот иногда используется для подтверждения статуса FIV+ у кошек. Дополнительные применения техники вестерн-блота включают ее использование Всемирным антидопинговым агентством (WADA). Кровяной допинг – это злоупотребление определенными техниками и/или веществами для увеличения массы эритроцитов, что позволяет организму транспортировать больше кислорода к мышцам и, следовательно, повышать выносливость и работоспособность. Существует три широко известных вещества или метода, используемых для кровяного допинга, а именно эритропоэтин (ЭПО), синтетические носители кислорода и переливание крови. Все они запрещены в соответствии с перечнем запрещенных веществ и методов WADA. Техника вестерн-блота использовалась во время чемпионата мира по футболу 2014 года в антидопинговой кампании этого мероприятия. В общей сложности было собрано и проанализировано более 1000 образцов Reichel и др. При использовании горизонтального SAR PAGE в сочетании с предварительно отлитыми гелями Velum SAR, поддерживаемыми пленкой, дискриминационная способность микродозового применения rEPO была значительно повышена. Помимо применения вестерн-блота в научных исследованиях, он также используется в клинических исследованиях. Поскольку его можно применять к процессу прямой идентификации белка, вестерн-блот считается мощным диагностическим инструментом, который часто используется в клинической практике. WB и методы обнаружения белков могут использоваться для выявления биомаркеров заболеваний, таких как специфические белки или антитела. Считается, что это жизнеспособный метод для идентификации определенных белков при диагностике таких заболеваний, как рак, аутоиммунные заболевания и прионные расстройства. Обнаружение нескольких биомаркеров, используемых при диагностике неврологических и онкологических заболеваний с помощью вестерн-блотинга, является распространенной процедурой. Например, широко распространено мнение, что появление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) значительно усложнило эффективную терапию рака. Поэтому раннее, точное и чувствительное выявление механизмов МЛУ имеет важное значение, а также поиск более эффективных химиотерапевтических подходов для применения в клинической практике. Экспрессия MDR1/P-гликопротеина в клеточных линиях P388/ADR, P388 и HCT 15 исследуется с использованием техники WB. WB также идентифицировал уровни MRP1. С другой стороны, поскольку вестерн-блот способен различать различные изоформы белка, он может использоваться для диагностики прионных и заболеваний, связанных с изоформами белка, таких как рак. Например, анализ вестерн-блотингом паттерна изоформ белков 14-3-3 в спинномозговой жидкости может выявить болезнь Крейтцфельдта-Якоба. Кроме того, болезнь легких фермеров – это легочное заболевание, вызванное вдыханием антигенных частиц, и исследования показали, что вестерн-блот может быть полезным вариантом для выявления иммунореактивных белков, связанных с болезнью легких фермеров. Вестерн-блот используется для оценки уровней экспрессии белка FSTL1 у людей с остеоартритом коленного сустава, что служит потенциальным биомаркером повреждения суставов. Кроме того, он используется для выявления белков в синовиальной жидкости и сыворотке крови, что позволяет диагностировать клинические симптомы остеоартрита и ревматоидного артрита. Он используется для оценки уровней экспрессии белка FSTL1 у людей с остеоартритом коленного сустава, что служит потенциальным биомаркером повреждения суставов.

The western blot (sometimes called the protein immunoblot), or western blotting, is a widely used analytical technique in molecular biology and immunogenetics to detect specific proteins in a sample of tissue homogenate or extract. Besides detecting the proteins, this technique is also utilized to visualize, distinguish, and quantify the different proteins in a complicated protein combination. Western blot technique uses three elements to achieve its task of separating a specific protein from a complex: separation by size, transfer of protein to a solid support, and marking target protein using a primary and secondary antibody to visualize. A secondary antibody is added which recognizes and binds to the primary antibody. The secondary antibody is visualized through various methods such as staining, immunofluorescence, and radioactivity, allowing indirect detection of the specific target protein. The confirmatory HIV test employs a western blot to detect anti HIV antibody in a human serum sample. Proteins from known HIV infected cells are separated and blotted on a membrane as above. Then, the serum to be tested is applied in the primary antibody incubation step; free antibody is washed away, and a secondary anti human antibody linked to an enzyme signal is added. The stained bands then indicate the proteins to which the patient's serum contains antibody. A western blot is also used as the definitive test for variant Creutzfeldt–Jakob disease, a type of prion disease linked to the consumption of contaminated beef from cattle with bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease'). Another application is in the diagnosis of tularemia. An evaluation of the western blot's ability to detect antibodies against F. tularensis revealed that its sensitivity is almost 100% and the specificity is 99.6%. Some forms of Lyme disease testing employ western blotting. A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV 2 (Herpes Type 2) infection. In veterinary medicine, a western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats. Further applications of the western blot technique include its use by the World Anti Doping Agency (WADA). Blood doping is the misuse of certain techniques and/or substances to increase one's red blood cell mass, which allows the body to transport more oxygen to muscles and therefore increase stamina and performance. There are three widely known substances or methods used for blood doping, namely, erythropoietin (EPO), synthetic oxygen carriers and blood transfusions. Each is prohibited under WADA's List of Prohibited Substances and Methods. The western blot technique was used during the 2014 FIFA World Cup in the anti doping campaign for that event. In total, over 1000 samples were collected and analysed by Reichel, et al. With the adoption of the horizontal SAR PAGE in combination with the precast film supported Velum SAR gels the discriminatory capacity of micro dose application of rEPO was significantly enhanced. In addition to the application of western blot in scientific research, it is also utilized in clinical research areas. Since it can be applied to the direct protein identification process, western blot is regarded as a powerful diagnostic tool that is frequently used in the clinic setting. WB and protein detection techniques can be used to find disease biomarkers like specific proteins or antibodies. It is thought to be a viable method for identifying particular proteins during the diagnosis of diseases like cancer, autoimmune disease, and prion disorders. The detection of several biomarkers used in the diagnosis of neurological and oncological illnesses by Western blotting is a common procedure. For instance, it is widely believed that the advent of multidrug resistance (MDR) has made effective cancer therapy extremely challenging. Therefore, early, accurate, and sensitive MDR mechanism discovery is essential, as is the search for more effective chemotherapeutic approaches for application in clinical settings. The expression of MDR1/P glycoprotein in the P388/ADR, P388 and HCT 15 cell lines is examined using the WB technique. WB has also identified MRP1 levels. On the other hand, as western blot has the potential to distinguish different protein isoforms, it may be used to diagnose prion and protein isoform related diseases, such as cancer. For instance, the western blotting analysis of the isoform pattern of 14 3 3 proteins in cerebral fluid can identify Creutzfeldt Jakob disease. Also, Farmers lung disease is a pulmonary condition brought on by breathing antigenic particles, and studies have indicated that western blot may be a useful option for identifying immunoreactive proteins related to farmers lung disease. western blot is used to assess the levels of FSTL1 protein expression in individuals with knee osteoarthritis, which serves as a potential biomarker of articular damage. Additionally, it is used to identify proteins in synovial fluid and serum, enabling the diagnosis of osteoarthritis and rheumatoid arthritis clinical symptoms. It is used to assess the levels of FSTL1 protein expression in individuals with knee osteoarthritis, which serves as a potential biomarker of articular damage.

Определение локализации белка в клетках

Для разработки лекарственных препаратов, выявления терапевтических мишеней и проведения биологических исследований необходимо понимать, где именно в клетке локализованы белки. Субклеточная локализация белков внутри клетки тесно связана с их функциями. Взаимосвязь между функцией белка и его локализацией позволяет предположить, что при перемещении белков их функции могут изменяться или приобретать новые свойства. Существуют различные методы для определения субклеточной локализации белка. Для идентификации субклеточной локализации белка разработано и используется множество эффективных и надежных вычислительных инструментов и стратегий. В сочетании с методами субклеточного фракционирования, вестерн-блоттинг (WB) остается важным базовым методом для изучения и понимания локализации белков.

Процедура

Метод вестерн-блотта состоит из гелевого электрофореза для разделения нативных белков по трехмерной структуре или денатурированных белков по длине полипептидной цепи, за которым следует электрофоретический перенос на мембрану (обычно PVDF или нитроцеллюлозу) и процедура иммуноокрашивания для визуализации определенного белка на мембране. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) обычно используется для денатурирующего электрофоретического разделения белков. Додецилсульфат натрия (SDS) обычно используется в качестве буфера (а также в составе геля), чтобы придать всем присутствующим белкам однородный отрицательный заряд, поскольку белки могут иметь положительный, отрицательный или нейтральный заряд. Перед электрофорезом белковые образцы часто кипятят для денатурации содержащихся в них белков. Это обеспечивает разделение белков по размеру и предотвращает деградацию образцов протеазами (ферментами, расщепляющими белки). После электрофоретического разделения белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозу или PVDF). Затем мембрану часто окрашивают Ponceau S для визуализации белков на блотте и подтверждения эффективности переноса. Далее белки блокируют молоком (или другими блокирующими агентами) для предотвращения неспецифического связывания антител, а затем окрашивают антителами, специфичными к целевому белку. Помимо этого, для получения достаточного количества целевого белка необходим оптимальный буфер для лизиса, поскольку он обеспечивает растворение белка и предотвращает его деградацию. После завершения подготовки образца белковое содержимое готово к разделению с помощью гелевого электрофореза. Для нормализации вестерн-блотта описано не менее семи различных подходов к окрашиванию общего белка: Ponceau S, методы без окрашивания, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R 350, Amido Black и Cy5.

Блокировка

Поскольку мембрана была выбрана из-за ее способности связывать белок, а антитела и целевой белок являются белками, необходимо предпринять шаги для предотвращения взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для обнаружения целевого белка. Блокирование неспецифического связывания достигается путем помещения мембраны в разбавленный раствор белка – обычно 3–5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) или обезжиренного сухого молока (оба недороги) в трис-буферном солевом растворе (TBS) или I Block, с небольшим процентом (0,1%) детергента, такого как Tween 20 или Triton X 100. Хотя обезжиренное сухое молоко предпочтительнее из-за его доступности, необходимо подобрать подходящий блокирующий раствор, так как не все белки в молоке совместимы со всеми полосами обнаружения или эпикоккононом. Эта процедура обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибок или неполного переноса. (см. нормализацию вестерн-блота)

Колориметрическое обнаружение

Метод колориметрического обнаружения основан на инкубации вестерн-блота с субстратом, который реагирует с репортерным ферментом (например, пероксидазой), связанным со вторичным антителом. Это преобразует растворимый краситель в нерастворимую форму другого цвета, которая осаждается вблизи фермента, тем самым окрашивая мембрану. Проявление блота затем останавливают путем удаления непрореагировавшего красителя промывкой. Уровни белка оцениваются с помощью денситометрии (интенсивность окрашивания) или спектрофотометрии.

Химиолюминесцентный детектор

Методы химиолюминесцентного детектирования основаны на инкубации вестерн-блота с субстратом, который люминесцирует при взаимодействии с репортером на вторичном антителе. Свет затем регистрируется ПЗС-камерами, которые создают цифровое изображение вестерн-блота или фиксируется на фотопленке. Использование фотопленки для детектирования вестерн-блотов постепенно уходит в прошлое из-за нелинейности изображения (неточной количественной оценки). Анализ изображения проводится с помощью денситометрии, которая оценивает относительное количество окрашивания белка и количественно определяет результаты в единицах оптической плотности. Современное программное обеспечение позволяет проводить более глубокий анализ данных, например, анализ молекулярной массы, при использовании соответствующих стандартов.

Радиоактивное обнаружение

Радиоактивные метки не требуют ферментных субстратов, но позволяют непосредственно приложить медицинскую рентгеновскую пленку к вестерн-блоту, который проявляется под воздействием метки, создавая темные области, соответствующие интересующим белковым полосам (см. изображение выше). Значение методов радиоактивного детектирования снижается из-за опасного излучения, высокой стоимости и рисков для здоровья и безопасности, в то время как ECL (усиленная хемолюминесценция) является полезной альтернативой.

Флуоресцентный детектор

Флуоресцентно меченый зонд возбуждается светом, а затем эмиссия возбуждения регистрируется фотосенсором, например, ПЗС-камерой (CCD-камерой), оснащенной соответствующими фильтрами для эмиссии, который захватывает цифровое изображение вестерн-блота и позволяет проводить дальнейший анализ данных, такой как анализ молекулярной массы и количественный анализ вестерн-блота. Флуоресценция считается одним из лучших методов для количественного определения, но она менее чувствительна, чем хемилюминесценция.

Вторичное зондирование

Одно из основных различий между нитроцеллюлозными и ПВДФ-мембранами заключается в их способности выдерживать удаление ("стриппинг") антител и последующее повторное использование мембраны для новых зондирований антителами. Хотя для нитроцеллюлозных мембран существуют хорошо разработанные протоколы удаления антител, более прочный ПВДФ позволяет проводить удаление легче и использовать мембрану повторно большее количество раз до тех пор, пока фоновый шум не станет ограничивающим фактором для экспериментов. Другое отличие состоит в том, что, в отличие от нитроцеллюлозы, ПВДФ необходимо замачивать в 95% этаноле, изопропаноле или метаноле перед использованием. ПВДФ-мембраны также, как правило, толще и более устойчивы к повреждениям в процессе работы.

Минимальные требования к западному блоту

Для обеспечения воспроизводимости результатов вестерн-блоттинга важно сообщать обо всех вышеупомянутых параметрах, включая подготовку образцов, концентрацию белка, используемую при загрузке, процентное содержание геля и условия проведения электрофореза, различные методы переноса, условия блокирования, концентрацию антител, а также методы идентификации и количественного определения. Многие опубликованные статьи не охватывают все эти переменные. Следовательно, крайне важно подробно описывать различные экспериментальные условия и параметры для повышения повторяемости и точности вестерн-блоттинга. Таким образом, для повышения воспроизводимости вестерн-блоттинга необходимы минимальные требования к отчетности.

2-D гелевой электрофорез

Двумерная SDS-PAGE использует принципы и методы, описанные выше. 2D SDS-PAGE, как следует из названия, предполагает миграцию полипептидов в двух измерениях. Например, в первом измерении полипептиды разделяются по изоэлектрической точке, а во втором – по молекулярной массе. Изоэлектрическая точка конкретного белка определяется относительным количеством положительно заряженных (например, лизина, аргинина) и отрицательно заряженных (например, глутамата, аспартата) аминокислот, при этом отрицательно заряженные аминокислоты способствуют низкой изоэлектрической точке, а положительно заряженные – высокой. Образцы также могут быть разделены сначала в невосстанавливающих условиях с использованием SDS-PAGE, а затем в восстанавливающих условиях во втором измерении, что приводит к разрыву дисульфидных связей, удерживающих субъединицы вместе. SDS-PAGE также может быть совмещена с уреа-PAGE для получения двухмерного геля. В принципе, этот метод позволяет разделить все клеточные белки на одном большом геле. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он часто позволяет различать различные изоформы конкретного белка, например, белок, подвергшийся фосфорилированию (путем присоединения отрицательно заряженной группы). Разделенные белки можно вырезать из геля и затем анализировать с помощью масс-спектрометрии для определения их молекулярной массы.

Проблемы обнаружения

Сигнал в данной области может быть слабым или отсутствовать по ряду причин, связанных с количеством использованных антител и антигена. Эту проблему можно решить, используя оптимальные концентрации и разведения антигена и антител, указанные в технической документации поставщика. Увеличение времени экспозиции в программном обеспечении системы детекции может усилить слабые полосы, вызванные низкой концентрацией образца и антител.

Одноклеточный западный блот

Одноклеточный WB (scWB), помимо традиционного WB, считается прорывом в изучении подклеточной локализации белков и оценке белка в отдельных клетках. Он применяется при измерении уровней и состояний экспрессии белка от клетки к клетке. Благодаря одноклеточному WB селективность и специфичность вестерн-блота были расширены и теперь включают анализ белка в отдельных клетках. Эта методика позволяет преодолеть ограничения, связанные с точностью и чувствительностью антител. Более того, благодаря своей универсальности, её можно использовать для одновременного измерения множества целевых белков в различных клеточных линиях и отдельных клетках.

Количественно определяемый западной блот на основе флуоресценции

Разработка, известная как количественная флуоресценция на основе вестерн-блоттинга (QFWB), позволяет исследователям проводить сравнительный анализ экспрессии с более высокой чувствительностью и точностью, чем когда-либо прежде. Термин "количественная" в QFWB означает подлинно количественный анализ с повышенной чувствительностью. Этот метод используется для выявления незначительных различий в экспрессии между различными образцами. Используя вторичное антитело, помеченное флуоресцентным красителем, QFWB обеспечивает линейный профиль детекции. Современные методы QFWB позволяют проводить одновременную двойную маркировку и обладают большей чувствительностью для выявления малейших изменений.

Количественный компьютеризированный западный блот

Количественный компьютеризированный анализ вестерн-блота оценивает реактивность отдельных антител к специфическим антигенам для выявления иммунодоминирующих и иммунорецессивных детерминант, используя два показателя, такие как чистая интенсивность полосы и общая интенсивность дорожки вестерн-блота. Идентификация определенных иммунодоминирующих антигенов позволяет создавать быстрые серодиагностические тесты и эффективные вакцины. В данном исследовании с помощью количественного компьютеризированного вестерн-блота ищутся серологические маркеры для ранней диагностики рака, вирусных и аутоиммунных заболеваний.

Высокопроизводительный западный блот (DigiWest)

Это методика, сочетающая в себе классическое разделение белков с помощью SDS-PAGE и платформу микромассивов на основе частиц, на которые иммобилизированы белки. Такое сочетание разделения белков, однородности и чувствительности позволяет быстро количественно оценить множество различных белковых мишеней, а также изменения в их количестве. Преимущество DigiWest заключается в том, что вестерн-блоттинг выполняется с использованием микромассивов на основе частиц, что обеспечивает одновременное обнаружение и анализ сотен различных белков и изменений в их количестве с использованием широкого спектра антител.

Микрофлюидный западный блот

Для обнаружения множества белков на одном микрофлюидном чипе выполняется микрофлюидный вестерн-блот, включающий несколько этапов: обогащение образца, определение размера белка, нанесение белка и последующий иммуноблоттинг in situ. В основе этой многоступенчатой процедуры лежит фотореактивный (под воздействием УФ-света) полиакриламидный гель и поверхность, способная к фотошаблонированию (под воздействием синего света). Благодаря улучшению аналитических характеристик, вестерн-блот теперь можно завершить за 10–60 минут, сохраняя при этом высокую чувствительность обнаружения (50 пикомолей) и уровни обнаружения мультиплексированных компонентов (фемтограммы). Таким образом, сочетая высокую специфичность и преимущества высокой пропускной способности мультиплексирования, вестерн-блот становится основой для быстрой протеомики.

Многополосный западный блот

Усовершенствованная методика вестерн-блоттинга, называемая мультистрип вестерн-блоттинг, основана на одновременном переносе различных белков из нескольких полос полиакриламидного геля на одну мембрану из поливинилидендифторида или нитроцеллюлозы. Мультистрип вестерн-блоттинг позволяет одновременно отслеживать до девяти различных белков из одной загрузки образца и в десять раз увеличить объем получаемых данных за один цикл вестерн-блоттинга. Эта методика будет полезна в системной биологии, исследованиях клеточной сигнализации и биомедицинской диагностике.

Западный блот на основе микрочипа капиллярного электрофореза

Капилярный и микрочиповый электрофорезный вестерн-блот был разработан для снижения количества необходимых образцов белка и времени, затрачиваемого на проведение вестерн-блота. Он позволяет более чувствительно и точно измерять различные белковые мишени из любого одноклеточного лизата, анализируемого на микрочипе. Для идентификации и количественной оценки одиннадцати различных белков достаточно всего 400 нанограммов клеточного лизата.