Метод обнаружения антигена с использованием антитела и фермента

Введение

Иммуноферментный анализ (ИФА) (//'/l//aɪ//z//ə/, , /iː/'/l//aɪ//z//ə/) – широко используемый аналитический биохимический метод, впервые описанный Евой Энгвалл и Питером Перлманном в 1971 году. Анализ представляет собой твердофазный тип иммуноферментного анализа (ИФА), используемый для выявления присутствия лиганда (обычно белка) в жидком образце с использованием антител, направленных против определяемого лиганда. ИФА применяется в качестве диагностического инструмента в медицине, патологии растений и биотехнологии, а также для контроля качества в различных отраслях промышленности. В простейшем варианте ИФА антигены из исследуемого образца прикрепляются к поверхности. Затем на поверхность наносят соответствующее антитело для связывания с антигеном. Это антитело конъюгировано с ферментом, после чего удаляют все несвязавшиеся антитела. На заключительном этапе добавляется вещество, содержащее субстрат фермента. Если произошло связывание, последующая реакция генерирует обнаруживаемый сигнал, чаще всего изменение цвета. Для проведения ИФА требуется как минимум одно антитело, обладающее специфичностью к определенному антигену. Образец с неизвестным количеством антигена иммобилизуют на твердом носителе (обычно полистиролевой микротитрационной пластине) неспецифически (путем адсорбции на поверхность) или специфически (путем захвата другим антителом, специфичным к тому же антигену, в так называемом "сэндвич" ИФА). После иммобилизации антигена добавляют детекционное антитело, образующее комплекс с антигеном. Детекционное антитело может быть ковалентно связано с ферментом или обнаруживаться вторичным антителом, конъюгированным с ферментом посредством биоконъюгации. Между каждым этапом пластину обычно промывают мягким моющим раствором для удаления любых белков или антител, неспецифически связанных. После финальной промывки пластину обрабатывают, добавляя ферментативный субстрат для получения видимого сигнала, указывающего на количество антигена в образце. Важно отметить, что ИФА может использоваться для других видов анализа связывания лигандов, а не только для строго "иммуно" анализов, хотя название сохранило исходное "иммуно" из-за широкого применения и истории развития этого метода. Техника требует любого лигандного реагента, который может быть иммобилизован на твердой фазе, а также детекционного реагента, который будет специфически связываться и использовать фермент для генерации сигнала, который можно точно количественно оценить. Между промывками на твердой фазе специфически связаны только лиганд и его специфические связывающие партнеры или "иммуносорбированы" посредством взаимодействия антиген-антитело, в то время как неспецифические или несвязанные компоненты удаляются при промывке. В отличие от других спектрофотометрических лабораторных методов, где ту же реакционную ячейку (например, кювету) можно повторно использовать после промывки, продукты реакции в пластинах ИФА иммуносорбированы на твердой фазе, являющейся частью пластины, и поэтому не могут быть легко повторно использованы.

The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (/ᵻ/'/l//aɪ//z//ə/, ,/iː/'/l//aɪ//z//ə/) is a commonly used analytical biochemistry assay, first described by Eva Engvall and Peter Perlmann in 1971. The assay is a solid phase type of enzyme immunoassay (EIA) to detect the presence of a ligand (commonly a protein) in a liquid sample using antibodies directed against the ligand to be measured. ELISA has been used as a diagnostic tool in medicine, plant pathology, and biotechnology, as well as a quality control check in various industries. In the most simple form of an ELISA, antigens from the sample to be tested are attached to a surface. Then, a matching antibody is applied over the surface so it can bind the antigen. This antibody is linked to an enzyme and then any unbound antibodies are removed. In the final step, a substance containing the enzyme's substrate is added. If there was binding, the subsequent reaction produces a detectable signal, most commonly a color change. Performing an ELISA involves at least one antibody with specificity for a particular antigen. The sample with an unknown amount of antigen is immobilized on a solid support (usually a polystyrene microtiter plate) either non specifically (via adsorption to the surface) or specifically (via capture by another antibody specific to the same antigen, in a "sandwich" ELISA). After the antigen is immobilized, the detection antibody is added, forming a complex with the antigen. The detection antibody can be covalently linked to an enzyme or can itself be detected by a secondary antibody that is linked to an enzyme through bioconjugation. Between each step, the plate is typically washed with a mild detergent solution to remove any proteins or antibodies that are non specifically bound. After the final wash step, the plate is developed by adding an enzymatic substrate to produce a visible signal, which indicates the quantity of antigen in the sample. Of note, ELISA can perform other forms of ligand binding assays instead of strictly "immuno" assays, though the name carried the original "immuno" because of the common use and history of development of this method. The technique essentially requires any ligating reagent that can be immobilized on the solid phase along with a detection reagent that will bind specifically and use an enzyme to generate a signal that can be properly quantified. In between the washes, only the ligand and its specific binding counterparts remain specifically bound or "immunosorbed" by antigen antibody interactions to the solid phase, while the nonspecific or unbound components are washed away. Unlike other spectrophotometric wet lab assay formats where the same reaction well (e. g., a cuvette) can be reused after washing, the ELISA plates have the reaction products immunosorbed on the solid phase, which is part of the plate, and so are not easily reusable.

Принцип

В качестве аналитического биохимического анализа и метода, выполняемого в "мокрых" условиях, ELISA включает в себя обнаружение аналита (то есть конкретного вещества, присутствие которого анализируется количественно или качественно) в жидком образце посредством метода, который продолжает использовать жидкие реагенты в ходе анализа (то есть контролируемую последовательность биохимических реакций, генерирующих сигнал, который можно легко количественно оценить и интерпретировать как меру количества аналита в образце). Этот процесс протекает в жидкой среде и происходит внутри реакционной камеры или лунки, необходимой для удержания реагентов. Это отличается от методов, выполняемых в "сухих" условиях, которые используют сухие полоски. Даже если образец является жидким (например, небольшая измеренная капля), заключительный этап обнаружения в "сухом" анализе включает считывание сухой полоски с помощью таких методов, как рефлектометрия, и не требует реакционной камеры для предотвращения перелива или смешивания между образцами. Как гетерогенный анализ, ELISA разделяет некоторые компоненты аналитической реакционной смеси, адсорбируя определенные компоненты на твердую фазу, которая физически иммобилизована. В ELISA жидкий образец добавляется на стационарную твердую фазу, обладающую специальными связывающими свойствами, после чего последовательно добавляются, инкубируются и промываются несколько жидких реагентов, а затем происходит некоторое оптическое изменение (например, развитие цвета в результате ферментативной реакции) в конечной жидкости в лунке, по которому измеряется количество аналита. Количественное "считывание" обычно основано на обнаружении интенсивности прошедшего света с помощью спектрофотометрии, которая включает количественную оценку пропускания света определенной длины волны через жидкость (а также прозрачное дно лунки в формате многолуночной пластины). Аналит также называют лигандом, поскольку он специфически связывается или лигируется с детекционным реагентом, таким образом, ELISA относится к более широкой категории анализов на связывание лигандов. (стационарная "твердая фаза"/"твердый субстрат" здесь, в отличие от твердых микрочастиц/гранул, которые могут быть смыты), которая обычно изготавливается в виде многолуночной пластины, известной как "ELISA-пластина". Как и в других формах иммуноанализа, обычно используется специфичность реакции антиген-антитело, поскольку легко получить антитело, специфичное к антигену, в больших количествах для использования в качестве реагента. В качестве альтернативы, если сам аналит является антителом, его целевой антиген может быть использован в качестве связывающего реагента.

As an analytical biochemistry assay and a "wet lab" technique, ELISA involves detection of an analyte (i. e., the specific substance whose presence is being quantitatively or qualitatively analyzed) in a liquid sample by a method that continues to use liquid reagents during the analysis (i. e., controlled sequence of biochemical reactions that will generate a signal which can be easily quantified and interpreted as a measure of the amount of analyte in the sample) that stays liquid and remains inside a reaction chamber or well needed to keep the reactants contained. This is in contrast to "dry lab" techniques that use dry strips. Even if the sample is liquid (e. g., a measured small drop), the final detection step in "dry" analysis involves reading of a dried strip by methods such as reflectometry and does not need a reaction containment chamber to prevent spillover or mixing between samples. As a heterogenous assay, ELISA separates some component of the analytical reaction mixture by adsorbing certain components onto a solid phase which is physically immobilized. In ELISA, a liquid sample is added onto a stationary solid phase with special binding properties and is followed by multiple liquid reagents that are sequentially added, incubated, and washed, followed by some optical change (e. g., color development by the product of an enzymatic reaction) in the final liquid in the well from which the quantity of the analyte is measured. The quantitative "reading" is usually based on detection of intensity of transmitted light by spectrophotometry, which involves quantitation of transmission of some specific wavelength of light through the liquid (as well as the transparent bottom of the well in the multiple well plate format). The analyte is also called the ligand because it will specifically bind or ligate to a detection reagent, thus ELISA falls under the bigger category of ligand binding assays. (the stationary "solid phase"/"solid substrate" here as opposed to solid microparticle/beads that can be washed away), which is usually constructed as a multiple well plate known as the "ELISA plate". Conventionally, like other forms of immunoassays, the specificity of antigen antibody type reaction is used because it is easy to raise an antibody specifically against an antigen in bulk as a reagent. Alternatively, if the analyte itself is an antibody, its target antigen can be used as the binding reagent.

История

До разработки ELISA единственным способом проведения иммуноанализа был радиоиммуноанализ – метод, использующий радиоактивно меченые антигены или антитела. В радиоиммуноанализе радиоактивность обеспечивает сигнал, указывающий на присутствие специфического антигена или антитела в образце. Радиоиммуноанализ впервые был описан в научной статье Розалин Суссман Ялоу и Соломона Берсона, опубликованной в 1960 году. Поскольку радиоактивность представляет потенциальную опасность для здоровья, искали более безопасную альтернативу. Подходящая альтернатива радиоиммуноанализу должна была заменить радиоактивный сигнал на нерадиоактивный. Когда ферменты (например, хрен-пероксидаза) реагируют с соответствующими субстратами (например, ABTS или TMB), происходит изменение цвета, которое используется в качестве сигнала. Однако сигнал должен быть связан с наличием антитела или антигена, поэтому фермент должен быть конъюгирован с соответствующим антителом. Этот процесс конъюгации был независимо разработан Стратисом Аврамеасом и Г. Б. Пирсом. Поскольку необходимо удалять несвязанные антитела или антигены путем промывки, антитела или антигены должны быть иммобилизованы на поверхности контейнера, то есть необходимо подготовить иммуносорбент. Метод для этого был опубликован Уайдом и Джеркером Поратом в 1966 году. В 1971 году Питер Перлманн и Ева Энгвалл из Стокгольмского университета в Швеции, а также Антон Шуурс и Бауке ван Веймен в Нидерландах независимо опубликовали работы, объединившие эти знания в методы проведения ЭИА/ELISA. Традиционная ELISA обычно использует хромогенные репортеры и субстраты, которые производят наблюдаемое изменение цвета, указывающее на присутствие антигена или аналита. Более современные методы, подобные ELISA, используют флуорогенные, электрохемилюминесцентные и количественные ПЦР-репортеры для создания количественно определяемых сигналов. Эти новые репортеры могут иметь различные преимущества, включая более высокую чувствительность и мультиплексирование. Строго говоря, новые анализы этого типа не являются ELISA, поскольку они не являются «ферментно-связанными», а связаны с неферментными репортерами. Однако, учитывая, что общие принципы этих анализов во многом схожи, их часто объединяют в одну категорию с ELISA. В 2012 году ультрачувствительный ELISA-тест на основе ферментов, использующий наночастицы в качестве хромогенного репортера, смог обеспечить видимый невооруженным глазом цветовой сигнал при обнаружении всего лишь аттограммов аналита. Положительные результаты отображаются синим цветом, а отрицательные – красным. Следует отметить, что это обнаружение может только подтвердить наличие или отсутствие аналита, но не его фактическую концентрацию.

Before the development of the ELISA, the only option for conducting an immunoassay was radioimmunoassay, a technique using radioactively labeled antigens or antibodies. In radioimmunoassay, the radioactivity provides the signal, which indicates whether a specific antigen or antibody is present in the sample. Radioimmunoassay was first described in a scientific paper by Rosalyn Sussman Yalow and Solomon Berson published in 1960. As radioactivity poses a potential health threat, a safer alternative was sought. A suitable alternative to radioimmunoassay would substitute a nonradioactive signal in place of the radioactive signal. When enzymes (such as horseradish peroxidase) react with appropriate substrates (such as ABTS or TMB), a change in color occurs, which is used as a signal. However, the signal has to be associated with the presence of antibody or antigen, which is why the enzyme has to be linked to an appropriate antibody. This linking process was independently developed by Stratis Avrameas and G. B. Pierce. Since it is necessary to remove any unbound antibody or antigen by washing, the antibody or antigen has to be fixed to the surface of the container; i. e., the immunosorbent must be prepared. A technique to accomplish this was published by Wide and Jerker Porath in 1966. In 1971, Peter Perlmann and Eva Engvall at Stockholm University in Sweden, and Anton Schuurs and Bauke van Weemen in the Netherlands independently published papers that synthesized this knowledge into methods to perform EIA/ELISA. Traditional ELISA typically involves chromogenic reporters and substrates that produce some kind of observable color change to indicate the presence of antigen or analyte. Newer ELISA like techniques use fluorogenic, electrochemiluminescent, and quantitative PCR reporters to create quantifiable signals. These new reporters can have various advantages, including higher sensitivities and multiplexing. In technical terms, newer assays of this type are not strictly ELISAs, as they are not "enzyme linked", but are instead linked to some nonenzymatic reporter. However, given that the general principles in these assays are largely similar, they are often grouped in the same category as ELISAs. In 2012, an ultrasensitive, enzyme based ELISA test using nanoparticles as a chromogenic reporter was able to give a naked eye colour signal, from the detection of mere attograms of analyte. A blue color appears for positive results and red color for negative. Note that this detection only can confirm the presence or the absence of analyte, not the actual concentration.

Типы

Существует множество ELISA-тестов для определения конкретных молекул, в которых используются соответствующие антитела. ELISA-тесты классифицируются на несколько типов в зависимости от способа связывания и использования аналитов и антител. Основные типы описаны ниже.

Сэндвич

Для обнаружения антигена образца используется "сэндвич" ELISA. Этапы следующие: поверхность подготавливается с известным количеством захватывающего антитела. Любые неспецифические участки связывания на поверхности блокируются. Образец, содержащий антиген, наносится на планшет и захватывается антителом. Планшет промывается для удаления несвязанного антигена. Добавляется специфическое антитело, которое связывается с антигеном (отсюда и название "сэндвич": антиген зажат между двумя антителами). Это первичное антитело может содержаться в сыворотке донора для проверки его реактивности к антигену. В качестве детекционных антител используются ферментно-конъюгированные вторичные антитела, которые специфически связываются с Fc-фрагментом антитела (неспецифично). Планшет промывается для удаления несвязанных ферментных конъюгатов антител. Затем добавляется химическое вещество, которое фермент преобразует в цветной, флуоресцентный или электрохимический сигнал. Поглощение, флуоресценция или электрохимический сигнал (например, ток) в лунках планшета измеряются для определения наличия и количества антигена. Изображение справа демонстрирует использование вторичного антитела, конъюгированного с ферментом, хотя, строго говоря, это не обязательно, если первичное антитело конъюгировано с ферментом (в этом случае это прямой ELISA). Однако использование вторичного конъюгата антител позволяет избежать дорогостоящего процесса создания ферментно-связанных антител для каждого антигена, который необходимо обнаружить. Используя ферментно-связанное антитело, которое связывает Fc-фрагмент других антител, одно и то же ферментно-связанное антитело можно использовать в различных ситуациях. Без первого слоя "захватывающего" антитела любые белки в образце (включая белки сыворотки) могут конкурентно адсорбироваться на поверхности планшета, снижая количество иммобилизованного антигена. Использование очищенного специфического антитела для связывания антигена с пластиком устраняет необходимость очистки антигена от сложных смесей перед измерением, упрощая анализ и повышая его специфичность и чувствительность. Поэтому "сэндвич" ELISA, используемая в исследованиях, часто требует валидации для снижения риска ложноположительных результатов.

A "sandwich" ELISA is used to detect sample antigen. The steps are:

A surface is prepared with a known quantity of capture antibody. Any nonspecific binding sites on the surface are blocked. The antigen containing sample is applied to the plate, and captured by antibody. The plate is washed to remove unbound antigen. A specific antibody is added, and binds to antigen (hence the 'sandwich': the antigen is stuck between two antibodies). This primary antibody could be in the serum of a donor, to be tested for reactivity towards the antigen. Enzyme linked secondary antibodies are applied as detection antibodies, which bind specifically to the antibody's Fc region (nonspecific). The plate is washed to remove the unbound antibody enzyme conjugates. A chemical is added to be converted by the enzyme into a color, fluorescent, or electrochemical signal. The absorbance, fluorescence, or electrochemical signal (e. g., current) of the plate's wells is measured to determine the presence and quantity of the antigen. The image to the right includes the use of a secondary antibody conjugated to an enzyme, although, in the technical sense, this is not necessary if the primary antibody is conjugated to an enzyme (which would be direct ELISA). However, the use of a secondary antibody conjugate avoids the expensive process of creating enzyme linked antibodies for every antigen one might want to detect. By using an enzyme linked antibody that binds the Fc region of other antibodies, this same enzyme linked antibody can be used in a variety of situations. Without the first layer of "capture" antibody, any proteins in the sample (including serum proteins) may competitively adsorb to the plate surface, lowering the quantity of antigen immobilized. Use of the purified specific antibody to attach the antigen to the plastic eliminates a need to purify the antigen from complicated mixtures before the measurement, simplifying the assay, and increasing the specificity and the sensitivity of the assay. Therefore, a sandwich ELISA used for research often needs validation, to reduce the risk of false positive results.

Конкурентоспособный

Третье применение ЭЛИСА – конкурентное связывание. Этапы этого ЭЛИСА несколько отличаются от первых двух примеров: немеченые антитела инкубируются в присутствии их антигена (образца). Эти связанные антитело-антигенные комплексы затем добавляются в лунку, покрытую антигеном. Плита промывается для удаления несвязанных антител. (Чем больше антигена в образце, тем больше образуется комплексов Ag Ab, и, следовательно, меньше свободных антител доступно для связывания с антигеном в лунке, отсюда и название "конкуренция"). Добавляется вторичное антитело, специфичное к первичному антителу. Это второе антитело конъюгировано с ферментом. Добавляется субстрат, и оставшиеся ферменты вызывают хромогенный или флуоресцентный сигнал. Реакция останавливается, чтобы предотвратить возможное насыщение сигнала. Некоторые наборы для конкурентного ЭЛИСА включают антиген, связанный с ферментом, а не антитело, связанное с ферментом. Меченый антиген конкурирует с антигеном образца (немеченым) за места связывания с первичными антителами. Чем меньше антигена в образце, тем больше меченого антигена остается в лунке и тем сильнее сигнал. Обычно антиген не помещают в лунку первым. Для обнаружения антител к ВИЧ лунки микротитрационной пластины покрываются антигеном ВИЧ. Используются два специфических антитела, одно конъюгированное с ферментом, а другое присутствует в сыворотке (если сыворотка положительна по антителам). Между двумя антителами происходит кумулятивная конкуренция за один и тот же антиген, что приводит к более сильному сигналу. Испытуемые сыворотки добавляют в эти лунки, инкубируют при 37 °C, а затем промывают. Если антитела присутствуют, происходит реакция антиген-антитело. Для фермента, меченого специфическими антителами к ВИЧ, антиген не остается. Эти антитела остаются свободными после добавления и удаляются во время промывки. Добавляется субстрат, но нет фермента, который мог бы на него действовать, поэтому положительный результат не показывает изменения цвета.