Immunocytochemistry

Введение

Иммуноцитохимия (ИКХ) - это общая лабораторная техника, которая используется для анатомической визуализации локализации определенного белка или антигена в клетках с помощью специфического первичного антитела, которое связывается с ним. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентным микроскопом, когда оно связано со вторичным антителом, имеющим конъюгированный флюорофор. ICC позволяет исследователям оценить, экспрессируют ли клетки в конкретном образце соответствующий антиген. В случаях, когда обнаруживается иммунопозитивный сигнал, ICC также позволяет исследователям определить, какие подклеточные отсеки экспрессируют антиген.

Иммуноцитохимия против иммуногистохимии

Иммуноцитохимия отличается от иммуногистохимии тем, что первая проводится на образцах нетронутых клеток, у которых удалена большая часть, если не вся, окружающая их внеклеточная матрица. Это включает в себя отдельные клетки, выделенные из блока твёрдой ткани, клетки, выращенные в культуре, клетки, отложенные из суспензии, или клетки, взятые из мазка. В отличие от этого, иммуногистохимические образцы представляют собой участки биологической ткани, где каждая клетка окружена архитектурой ткани и другими клетками, обычно встречающимися в неповрежденной ткани. Иммуноцитохимия - это метод, используемый для оценки наличия определенного белка или антигена в клетках (культивированных клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфического антитела, которое связывается с ним, что позволяет визуализировать и исследовать под микроскопом. Это ценный инструмент для определения содержания клеток в отдельных клетках. Образцы, которые можно анализировать, включают в себя мазки крови, аспираты, мазки, культивированные клетки и клеточные суспензии. Существует множество способов подготовки образцов клеток для иммуноцитохимического анализа. Каждый метод имеет свои сильные стороны и уникальные характеристики, поэтому можно выбрать правильный метод для желаемой образцы и результата. Клетки, подлежащие окрашиванию, могут быть прикреплены к прочной опоре, чтобы облегчить обращение в последующих процедурах. Это можно достичь несколькими методами: клеток, прикрепленных к ней, можно выращивать на микроскопических слайдах, на обложках или на оптически подходящей пластиковой подставке. Клетки суспензии могут быть центрифугированы на стеклянные слайды (цитоспин), привязаны к твердой опоре с использованием химических связующих элементов или в некоторых случаях обрабатываются в суспензии. Концентрированные клеточные суспензии, которые существуют в среде с низкой вязкостью, являются хорошими кандидатами для препаратов для мазков. Разбавленные клеточные суспензии, существующие в разбавленной среде, наиболее подходят для приготовления цитоспинов путем цитоцентрифугирования. Клетчатые суспензии, содержащиеся в среде с высокой вязкостью, наиболее подходят для испытания в качестве мазков. Одно из отличительных свойств этих препаратов заключается в том, что вся клетка присутствует на поверхности слитка. Для того, чтобы произошла межклеточная реакция, иммуноглобулин должен сначала пройти через мембрану клетки, которая в этих препаратах не повреждена. Реакции, происходящие в ядре, могут быть более сложными, а внеклеточные жидкости могут создавать уникальные препятствия в выполнении иммуноцитохимии. В этой ситуации становится необходимым проницаемость клеток с использованием моющего средства (Triton X 100 или Tween 20) или выбор органических фиксаторов (ацетон, метанол или этанол). Антитела являются важным инструментом для демонстрации как присутствия, так и подклеточной локализации антигена. Цветение клеток - очень универсальный метод, и, если антиген высоко локализован, можно обнаружить всего тысячу молекул антигена в клетке. В некоторых случаях клеточное окрашивание может также использоваться для определения приблизительной концентрации антигена, особенно с помощью анализатора изображений.

Immunocytochemistry differs from immunohistochemistry in that the former is performed on samples of intact cells that have had most, if not all, of their surrounding extracellular matrix removed. This includes individual cells that have been isolated from a block of solid tissue, cells grown within a culture, cells deposited from suspension, or cells taken from a smear. In contrast, immunohistochemical samples are sections of biological tissue, where each cell is surrounded by tissue architecture and other cells normally found in the intact tissue. Immunocytochemistry is a technique used to assess the presence of a specific protein or antigen in cells (cultured cells, cell suspensions) by use of a specific antibody, which binds to it, thereby allowing visualization and examination under a microscope. It is a valuable tool for the determination of cellular contents from individual cells. Samples that can be analyzed include blood smears, aspirates, swabs, cultured cells, and cell suspensions. There are many ways to prepare cell samples for immunocytochemical analysis. Each method has its own strengths and unique characteristics so the right method can be chosen for the desired sample and outcome. Cells to be stained can be attached to a solid support to allow easy handling in subsequent procedures. This can be achieved by several methods: adherent cells may be grown on microscope slides, coverslips, or an optically suitable plastic support. Suspension cells can be centrifuged onto glass slides (cytospin), bound to solid support using chemical linkers, or in some cases handled in suspension. Concentrated cellular suspensions that exist in a low viscosity medium make good candidates for smear preparations. Dilute cell suspensions existing in a dilute medium are best suited for the preparation of cytospins through cytocentrifugation. Cell suspensions that exist in a high viscosity medium, are best suited to be tested as swab preparations. The constant among these preparations is that the whole cell is present on the slide surface. For any intercellular reaction to take place, immunoglobulin must first traverse the cell membrane that is intact in these preparations. Reactions taking place in the nucleus can be more difficult, and the extracellular fluids can create unique obstacles in the performance of immunocytochemistry. In this situation, permeabilizing cells using detergent (Triton X 100 or Tween 20) or choosing organic fixatives (acetone, methanol, or ethanol) becomes necessary. Antibodies are an important tool for demonstrating both the presence and the subcellular localization of an antigen. Cell staining is a very versatile technique and, if the antigen is highly localized, can detect as few as a thousand antigen molecules in a cell. In some circumstances, cell staining may also be used to determine the approximate concentration of an antigen, especially by an image analyzer.

Методы

Существует множество методов для получения иммунологического обнаружения тканей, включая те, которые связаны непосредственно с первичными антителами или антисерами. Прямой метод включает в себя использование обнаруживаемого метка (например, флуоресцентной молекулы, частиц золота и т. д.) непосредственно на антитело, которое затем связывается с антигеном (например, белком) в клетке. В качестве альтернативы существует множество косвенных методов. В одном из таких методов антиген связывается с первичным антителом, который затем усиливается с помощью вторичного антитела, которое связывается с первичным антителом. Далее применяется третичный реагент, содержащий ферментативную часть, которая связывается со вторичным антителом. При применении кватернарного реагента или субстрата ферментативный конец третичного реагента преобразует субстрат в пигментный реакционный продукт, который производит цвет (возможны многие цвета; коричневый, черный, красный и т. д.) в том же месте, где первоначальное первичное антитело распознало интересующий антиген. Некоторые примеры используемых субстратов (также известных как хромогены) - AEC (3-амино-9-этилкарбазол) или DAB (3,3'-диаминобензидин). Применение одного из этих реагентов после воздействия необходимого фермента (например, пероксидазы хрена, конъюгированной с реагентом для антитела) приводит к получению положительного продукта иммунореакции. Иммуноцитохимическая визуализация специфических антигенов может использоваться, когда менее специфическое окрашивание, такое как H&E (гематоксилин и эозин), не может быть использовано для постановки диагноза или для предоставления дополнительной предсказательной информации относительно лечения (например, при некоторых видах рака). В качестве альтернативы вторичное антитело может быть ковалентно связано с флюорофором (наиболее распространенными являются FITC и родамин), который обнаруживается в флуоресцентном или конфокальном микроскопе. Местоположение флуоресценции будет варьироваться в зависимости от молекулы-мишени, внешнее для мембранных белков и внутреннее для цитоплазматических белков. Таким образом, иммунофлуоресценция является мощным методом в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения местоположения белков и динамических процессов (экзоцитоз, эндоцитоз и т. д.). )

There are many methods to obtain immunological detection on tissues, including those tied directly to primary antibodies or antisera. A direct method involves the use of a detectable tag (e. g., fluorescent molecule, gold particles, etc., ) directly to the antibody that is then allowed to bind to the antigen (e. g., protein) in a cell. Alternatively, there are many indirect methods. In one such method, the antigen is bound by a primary antibody which is then amplified by use of a secondary antibody which binds to the primary antibody. Next, a tertiary reagent containing an enzymatic moiety is applied and binds to the secondary antibody. When the quaternary reagent, or substrate, is applied, the enzymatic end of the tertiary reagent converts the substrate into a pigment reaction product, which produces a color (many colors are possible; brown, black, red, etc.,) in the same location that the original primary antibody recognized that antigen of interest. Some examples of substrates used (also known as chromogens) are AEC (3 Amino 9 EthylCarbazole), or DAB (3,3' Diaminobenzidine). Use of one of these reagents after exposure to the necessary enzyme (e. g., horseradish peroxidase conjugated to an antibody reagent) produces a positive immunoreaction product. Immunocytochemical visualization of specific antigens of interest can be used when a less specific stain like H&E (Hematoxylin and Eosin) cannot be used for a diagnosis to be made or to provide additional predictive information regarding treatment (in some cancers, for example). Alternatively the secondary antibody may be covalently linked to a fluorophore (FITC and Rhodamine are the most common) which is detected in a fluorescence or confocal microscope. The location of fluorescence will vary according to the target molecule, external for membrane proteins, and internal for cytoplasmic proteins. In this way immunofluorescence is a powerful technique when combined with confocal microscopy for studying the location of proteins and dynamic processes (exocytosis, endocytosis, etc. ).