Введение

Техника молекулярной биологии Репортерская система GUS (GUS: β глюкуронидаза) - это система репортерских генов, особенно полезная в молекулярной биологии и микробиологии растений. Существует несколько видов анализа гена-репортера GUS в зависимости от используемого субстрата. Термин "окрашивание GUS" относится к наиболее распространенному из них, гистохимическому методу.

Цель

Целью данного метода является анализ активности промотора транскрипции гена (в терминах экспрессии так называемого гена-репортера под регуляторным контролем этого промотора) либо количественно, с использованием некоторой меры активности, либо качественно (включен или выключен) посредством визуализации его активности в различных клетках, тканях или органах. Метод использует ген uidA Escherichia coli, который кодирует фермент β-глюкуронидазу; этот фермент, при инкубации с определенными бесцветными или нефлуоресцентными субстратами, может преобразовать их в стабильные цветные или флуоресцентные продукты. Наличие индуцированного цвета GUS указывает, где ген был активно экспрессирован. Таким образом, сильная активность промотора приводит к большому количеству окрашивания, а слабая активность промотора - к меньшему. Ген uidA также может быть объединен с интересующим геном, создавая генное слияние. Введение гена uidA вызывает выработку GUS, который затем можно обнаружить, используя различные глюкурониды в качестве субстратов. Этот процесс аналогичен гидролизу X-галя бета-галактозидазой.

История

Система была первоначально разработана Ричардом Энтони Джефферсоном во время его Ph. Доктор философии в Университете Колорадо в Боулдере. Он адаптировал технику для использования с растениями, когда работал в Институте селекции растений в Кембридже, в период с 1985 по 1987 год. Однако GUS восприимчив к ингибированию некоторыми ионами тяжелых металлов, такими как Cu2+ и Zn2+. Кроме того, интерпретация анализа ограничена движением диХ индиго по клетке. DiX индиго, может ассоциироваться с липидами, чтобы диффундировать далеко от места активности фермента, что показывает отсутствие цитозольной локализации и нерегулярность проникновения в субстрат. Это может привести к неправильной интерпретации локализации белка GUS. Несмотря на отсутствие клеточной локализации, ядерная локализация GUS была хорошо замечена. Для предотвращения диффузии пятна GUS-анализы могут проводиться в присутствии феррицианида калия.

Другие системы репортеров

Система GUS не является единственной доступной системой репортерного гена для анализа активности промотора. Другие конкурирующие системы основаны, например, на люциферазе, GFP, бета-галактозидазе, хлорамфениколевой ацетилтрансферазе (CAT), щелочной фосфатазе. Использование той или иной системы в основном зависит от рассматриваемого организма и технологий визуализации и микроскопии, доступных лабораториям, проводящим исследования.

Другие применения

Анализ GUS, а также другие системы репортерных генов могут использоваться для других видов исследований, отличных от классического анализа активности промотора. Системы репортеров использовались для определения эффективности систем доставки генов, внутриклеточной локализации продукта гена, обнаружения белковых белков или белковых взаимодействий ДНК, эффективности сигналов инициирования перевода и успеха усилий по молекулярному клонированию.