SMAD (protein)

Введение

Семья белков Smads (или SMADs) включает в себя семейство структурно похожих белков, которые являются основными преобразователями сигналов для рецепторов трансформирующего фактора роста бета (TGF B), которые имеют критическое значение для регулирования развития и роста клеток. Сокращение относится к гомологии с генами Caenorhabditis elegans SMA ("маленький" фенотип червя) и MAD ("Матери против декапентаплегии") генов в Drosophila. Существует три различных подтипа Smads: Smads с регулируемыми рецепторами (R Smads), Smads с общим партнером (Co Smads) и Smads с ингибирующими (I Smads). Восемь членов семьи Смад разделены между этими тремя группами. Тримеры двух рецепторно- регулируемых SMAD и одного со- SMAD действуют как факторы транскрипции, регулирующие экспрессию определенных генов.

Подтипы

R Smads состоят из Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 и Smad8/ 9, и участвуют в прямой передаче сигналов от рецептора TGF B. Smad4 - единственный известный человеческий Co Smad, и имеет роль партнерства с R Smads для привлечения ко-регуляторов к комплексу. Наконец, Smad6 и Smad7 - это I Smads, которые подавляют активность R Smads. В то время как Smad7 является общим ингибитором сигналов TGF B, Smad6 более конкретно ассоциируется с передачей сигналов BMP. R/Co Smads в основном расположены в цитоплазме, но накапливаются в ядре после передачи TGF β, где они могут связываться с ДНК и регулировать транскрипцию. Однако I Smads преимущественно обнаруживаются в ядре, где они могут действовать как прямые регуляторы транскрипции.

Открытие и номенклатура

До открытия Smads было неясно, какие эффекторы вниз по потоку отвечали за преобразование сигналов TGF B. СМД впервые были обнаружены у дрозофилы, в которой они известны как матери против dpp (Mad), мутации Mad могут быть помещены в аллельный ряд на основе относительной тяжести усиления материнского эффекта слабых аллелей dpp, объясняя таким образом название "матери против dpp". через генетический скрининг для доминантных усилителей декапентаплегического (dpp), версии TGF B, Drosophila. Исследования показали, что нулевые мутанты Mad имеют сходные фенотипы с мутантами dpp, что предполагает, что Mad играет важную роль в некоторых аспектах пути передачи сигналов dpp. Человеческий гомолог Мада и Смы был назван Smad1, сочетание ранее обнаруженных генов. При инъекции в эмбриональные крышки животных Xenopus, Smad1 был способен воспроизводить вентрализующий эффект мезодермы, который BMP4, член семейства TGF B, оказывает на эмбрионы. Кроме того, было продемонстрировано, что Smad1 обладает транзактивной способностью, локализованной на карбоксиконечном конце, которая может быть усилена путем добавления BMP4. Эти данные свидетельствуют о том, что Smad1 частично отвечает за преобразование сигналов TGF B.

Белок

Смады имеют длину примерно от 400 до 500 аминокислот и состоят из двух шаровых областей в амино- и карбокситерминалах, соединенных между собой линкерной областью. Эти шаровые области высоко консервативны в R Smads и Co Smads, и называются гомологией Mad 1 (MH1) на конце N, и MH2 на конце C. Домен MH2 также сохранен в I Smads. Домен MH1 в основном участвует в связывании ДНК, в то время как MH2 отвечает за взаимодействие с другими Smads, а также за распознавание транскрипционных коактиваторов и корепрессоров. R Smads и Smad4 взаимодействуют с несколькими ДНК-мотивами, хотя домен MH1. Эти мотивы включают CAGAC и его вариант CAGCC, а также последовательность консенсуса 5 bp GGC ((GC) ((CG). Р Smads, фосфорилированные рецепторами, могут образовывать гомотримеры, а также гетеротримеры с Smad4 in vitro, посредством взаимодействия между доменами MH2. Тримеры одной молекулы Smad4 и двух рецепторно- фосфорированных R Smad молекул, как полагают, являются преобладающими эффекторами регуляции транскрипции TGF β. Область стыковки между MH1 и MH2 является не только соединителем, но также играет роль в функции и регуляции белка. В частности, R Smads фосфорилируются в ядре в левостороннем домене CDK8 и 9, и эти фосфорилирования модулируют взаимодействие белков Smad с транскрипционными активаторами и репрессорами. Кроме того, после этой фазы фосфорилирования, линкер подвергается второму раунду фосфорилирования GSK3, маркируя Smads для их распознавания убиквитин-лигазами и нацеливаясь на их деградацию, опосредованную протеазомой. Активаторы транскрипции и убиквитин-лигазы содержат пары доменов WW. Эти домены взаимодействуют с мотивом PY, присутствующим в R Smad-линкере, а также с фосфорилированными остатками, расположенными вблизи мотива. Действительно, различные модели фосфорилирования, генерируемые CDK8/9 и GSK3, определяют специфические взаимодействия с активаторами транскрипции или с убиквитин- лигазами. Примечательно, что в области линкера наибольшая концентрация различий аминокислот среди метазоанов, хотя места фосфорилирования и мотив PY сильно консервативны.

Smads are roughly between 400 and 500 amino acids long, and consist of two globular regions at the amino and carboxy termini, connected by a linker region. These globular regions are highly conserved in R Smads and Co Smads, and are called Mad homology 1 (MH1) at the N terminus, and MH2 at the C terminus. The MH2 domain is also conserved in I Smads. The MH1 domain is primarily involved in DNA binding, while the MH2 is responsible for the interaction with other Smads and also for the recognition of transcriptional co activators and co repressors. R Smads and Smad4 interact with several DNA motifs though the MH1 domain. These motifs include the CAGAC and its CAGCC variant, as well as the 5 bp consensus sequence GGC(GC)|(CG). Receptor phosphorylated R Smads can form homotrimers, as well as heterotrimers with Smad4 in vitro, via interactions between the MH2 domains. Trimers of one Smad4 molecule and two receptor phosphorylated R Smad molecules are thought to be the predominant effectors of TGF β transcriptional regulation. The linker region between MH1 and MH2 is not just a connector, but also plays a role in protein function and regulation. Specifically, R Smads are phosphorylated in the nucleus at the linker domain by CDK8 and 9, and these phosphorylations modulate the interaction of Smad proteins with transcriptional activators and repressors. Furthermore, after this phosphorylation step, the linker undergoes a second round of phosphorylations by GSK3, labelling Smads for their recognition by ubiquitin ligases, and targeting them for proteasome mediated degradation. The transcription activators and the ubiquitin ligases both contain pairs of WW domains. These domains interact with the PY motif present in the R Smad linker, as well as with the phosphorylated residues located in the proximity of the motif. Indeed, the different phosphorylation patterns generated by CDK8/9 and GSK3 define the specific interactions with either transcription activators or with ubiquitin ligases. Remarkably, the linker region has the highest concentration of amino acid differences among metazoans, although the phosphorylation sites and the PY motif are highly conserved.

Сохранение последовательности

Компоненты TGF-бета-пути, и в частности R-Smads, Co-Smads и I-Smads, представлены в геноме всех метазоанов, секвенированных на сегодняшний день. Уровень сохранения последовательности белков Co Smad и R Smads среди разных видов чрезвычайно высок. Этот уровень сохранности компонентов и последовательностей предполагает, что общие функции TGF-бета-пути остаются в целом нетронутыми с тех пор. I Smads сохранили домены MH2, но расходятся домены MH1 по сравнению с R Smads и Co Smads.

R/Co-Smads (Р/Со-Смадс)

Лиганды TGF B связываются с рецепторами, состоящими из серин/треонинкиназ 1 и 2 типа, которые служат для внутриклеточного распространения сигнала. Связывание лигандов стабилизирует комплекс рецепторов, состоящий из двух рецепторов 1 типа и двух рецепторов 2 типа. Рецепторы типа 2 могут фосфорилировать рецепторы типа 1 в местах на домене GS, расположенных N-конце домена киназы типа 1. Фосфорилирование R Smad приводит к его диссоциации с SARA, выявляя ядерную импортовую последовательность, а также способствует его ассоциации с Co Smad. Затем этот комплекс Smad локализуется в ядре, где он способен связывать свои целевые гены с помощью других связанных белков.

Я-Я-Я-Я-Я-Я-Я

I Smads нарушают передачу сигналов TGF B с помощью различных механизмов, включая предотвращение ассоциации R Smads с рецепторами типа 1 и Co Smads, снижение регуляции рецепторов типа 1 и внесение транскрипционных изменений в ядро. Сохраненный MH2 домен I Smads способен связываться с рецепторами 1 типа, что делает его конкурентоспособным ингибитором связывания R Smad. После активации R Smad он образует гетеромерный комплекс с I Smad, что препятствует его ассоциации с Co Smad. Кроме того, I Smad привлекает убиквитин лигазу для таргетинга активированного R Smad для деградации, эффективно подавляя β-сигнал TGF. Анализы репортера показывают, что слияние I Smads с области связывания ДНК генов репортера уменьшает их экспрессию, предполагая, что I Smads функционируют как транскрипционные репрессоры.

Роль в контроле клеточного цикла

В взрослых клетках TGF β ингибирует прогрессирование клеточного цикла, останавливая клетки от перехода в фазу G1/ S. Это явление присутствует в эпителиальных клетках многих органов и частично регулируется сигнальным путем Smad. Точный механизм контроля немного отличается в зависимости от типа клеток. Одним из механизмов, с помощью которого Smads способствует цитостазу, индуцированному TGF B, является понижение регуляции Myc, который является фактором транскрипции, способствующим росту клеток. Myc также подавляет p15 ((Ink4b) и p21 ((Cip1), которые являются ингибиторами Cdk4 и Cdk2 соответственно. При отсутствии TGF β в цитоплазме присутствует репрессорный комплекс, состоящий из Smad3, и факторов транскрипции E2F4 и p107. Однако, когда присутствует сигнал TGF B, этот комплекс локализуется в ядре, где он связывается с Smad4 и связывается с ингибирующим элементом TGF B (TIE) промотора Myc для подавления его транскрипции. В дополнение к Myc, Smads также участвуют в понижающей регуляции белков ингибитора связывания ДНК (ID). ID - это факторы транскрипции, которые регулируют гены, участвующие в дифференцировке клеток, поддерживают мультипотентность в стволовых клетках и способствуют непрерывному клеточному циклированию. Поэтому понижающая регуляция белков ID является путем, с помощью которого сигнализация TGF B может остановить клеточный цикл. В микромассиве ДНК было обнаружено, что Id2 и Id3 подавляются TGF B, но индуцируются сигнализацией BMP. Нокаутирование генов Id2 и Id3 в эпителиальных клетках усиливает ингибирование клеточного цикла TGF B, показывая, что они важны для опосредованного цитостатического эффекта. СМД являются как прямым, так и косвенным ингибитором выражения ИД. Сигнал TGF B запускает фосфорилирование Smad3, которое, в свою очередь, активирует ATF3, транскрипционный фактор, который индуцируется во время клеточного стресса. Smad3 и ATF3 затем координируют подавление транскрипции Id1, в результате чего происходит ее понижение. Косвенно, снижение регуляции ID является вторичным эффектом подавления Myc Smad3. Поскольку Myc является индуктором Id2, понижение регуляции Myc также приведет к снижению передачи сигналов Id2, что способствует остановке клеточного цикла. Также было обнаружено, что белки Smad являются прямыми регуляторами транскрипции Cdk4. Репортерные анализы, в которых люцифераза была помещена под промотор Cdk4, показали повышенную экспрессию люциферазы, когда Smad4 был нацелен на siRNAs. У подавления Smad2 и 3 не было никакого значительного эффекта, что предполагает, что Cdk4 напрямую регулируется Smad4.

In adult cells, TGF β inhibits cell cycle progression, stopping cells from making the G1/S phase transition. This phenomenon is present in the epithelial cells of many organs, and is regulated in part by the Smad signaling pathway. The precise mechanism of control differs slightly between cell types. One mechanism by which Smads facilitate TGF B induced cytostasis is by downregulating Myc, which is a transcription factor that promotes cell growth. Myc also represses p15(Ink4b) and p21(Cip1), which are inhibitors of Cdk4 and Cdk2 respectively. When there is no TGF β present, a repressor complex composed of Smad3, and the transcription factors E2F4 and p107 exist in the cytoplasm. However, when TGF B signal is present, this complex localizes to the nucleus, where it associates with Smad4 and binds to the TGF B inhibitory element (TIE) of the Myc promoter to repress its transcription. In addition to Myc, Smads are also involved in the downregulation of Inhibitor of DNA Binding (ID) proteins. IDs are transcription factors that regulate genes involved in cell differentiation, maintaining multi potency in stem cells, and promoting continuous cell cycling. Therefore, downregulating ID proteins is a pathway by which TGF B signaling could arrest the cell cycle. In a DNA microarray screen, Id2 and Id3 were found to be repressed by TGF B, but induced by BMP signaling. Knocking out Id2 and Id3 genes in epithelial cells enhances cell cycle inhibition by TGF B, showing that they are important in mediating this cytostatic effect. Smads are both a direct and indirect inhibitor of Id expression. TGF B signal triggers Smad3 phosphorylation, which in turn activates ATF3, a transcription factor that is induced during cellular stress. Smad3 and ATF3 then coordinate to repress Id1 transcription, resulting in its downregulation. Indirectly, Id downregulation is a secondary effect of Myc repression by Smad3. Since Myc is an inducer of Id2, downregulating Myc will also result in reduced Id2 signaling, which contributes to cell cycle arrest. Smad proteins have also been found to be direct transcriptional regulators of Cdk4. Reporter assays in which luciferase was placed under a Cdk4 promoter showed increased luciferase expression when Smad4 was targeted with siRNAs. Repression of Smad2 and 3 did not have any significant effect, suggesting that Cdk4 is directly regulated by Smad4.

Роль Smad в раке

Дефекты в передаче сигналов Smad могут привести к резистентности TGF B, вызывая дисрегуляцию клеточного роста. Дерегуляция передачи сигналов TGF B связана со многими типами рака, включая рак поджелудочной железы, толстой кишки, молочной железы, легких и простаты. Smad4 чаще всего мутирует при раке человека, особенно при раке поджелудочной железы и толстой кишки. Smad4 инактивируется почти в половине случаев рака поджелудочной железы. В результате Smad4 был впервые назван Deleted in Pancreatic Cancer Locus 4 (DPC4) после его открытия. Мутации зародышевой линии Smad4 частично отвечают за генетическую предрасположенность к семейному ювенильному полипозу человека, что подвергает человека высокому риску развития потенциально раковых полипов желудочно- кишечного тракта. Экспериментальные доказательства, подтверждающие это наблюдение, получены в результате исследования, показывающего, что у гетерозиготных мышей с нокаутом Smad4 (+/ ) в течение 100 недель равномерно развивались полипы желудочно- кишечного тракта. Многие семейные мутанты Smad4 встречаются в домене MH2, что нарушает способность белка образовывать гомо- или гетероолигомеры, тем самым нарушая передачу сигнала TGF B. Несмотря на доказательства того, что Smad3 более важен, чем Smad2, в передаче сигналов TGF B, частота мутаций Smad3 при раке ниже, чем у Smad2. Опухолевые клетки хориокарциномы устойчивы к сигнализации TGF B, а также не обладают экспрессией Smad3. Исследования показывают, что повторного введения Smad3 в клетки хориокарциномы достаточно для повышения уровня TIMP 1 (ингибитор тканевой металлопротеазы 1), медиатора антиинвазивного эффекта TGF B, и, таким образом, восстановления сигнализации TGF B. Однако повторного введения Smad3 было недостаточно для восстановления антиинвазивного эффекта TGF B. Это говорит о том, что другие сигнальные механизмы, помимо Smad3, являются дефектными в резистентной к TGF B хориокарциноме. Это открытие кажется парадоксальным, поскольку ранее было показано, что TGF B оказывает нейропротекторное действие на пациентов с болезнью Альцгеймера. Это говорит о том, что некоторые аспекты передачи сигналов TGF B являются дефектными, в результате чего TGF B теряет свои нейропротекторные эффекты. Исследования показали, что фосфорилированный Smad2 эктопически локализуется в цитоплазматических гранулах, а не в ядре, в нейронах гиппокампа пациентов с болезнью Альцгеймера. В частности, эктопически расположенные фосфорилированные Smad2s были обнаружены в амилоидных бляшках и прикреплены к нейрофибриллярным узлам. Эти данные свидетельствуют о том, что Smad2 участвует в развитии болезни Альцгеймера. Недавние исследования показывают, что пептидилпролилцис транс изомераза NIMA взаимодействующая 1 (PIN1) участвует в стимулировании аномальной локализации Smad2. Было обнаружено, что Pin1 солокализуется с Smad2/3 и фосфорилированными белками тау в цитоплазматических гранулах, что предполагает возможное взаимодействие. Трансфекция клеток, экспрессирующих Smad2, Pin1 вызывает деградацию Smad2 при посредничестве протеазомы, а также повышенную ассоциацию Smad2 с фосфорилированным тау. Эта цикл обратной связи является двунаправленным; Smad2 также способен увеличить синтез Pin1 мРНК. Таким образом, эти два белка могут оказаться в "порочном круге" регуляции. Pin1 вызывает как себя, так и Smad2, чтобы быть связанными в нерастворимых нейрофибриллярных узлах, в результате чего низкие уровни обоих растворимых белков. Затем Smad2 способствует синтезу РНК Pin1 для попытки компенсировать, что только приводит к дальнейшей деградации Smad2 и ассоциации с нейрофибриллярными узлами.

Defects in Smad signaling can result in TGF B resistance, causing dysregulation of cell growth. Deregulation of TGF B signaling has been implicated in many cancer types, including pancreatic, colon, breast, lung, and prostate cancer. Smad4 is most commonly mutated in human cancers, particularly pancreatic and colon cancer. Smad4 is inactivated in nearly half of all pancreatic cancers. As a result, Smad4 was first termed Deleted in Pancreatic Cancer Locus 4 (DPC4) upon its discovery. Germline Smad4 mutations are partially responsible for genetic disposition for human familial juvenile polyposis, which puts a person at high risk of developing potentially cancerous gastrointestinal polyps. Experimental supporting evidence for this observation comes from a study showing that heterozygous Smad4 knockout mice (+/ ) uniformly developed gastrointestinal polyps by 100 weeks. Many familial Smad4 mutants occur on the MH2 domain, which disrupts the protein's ability to form homo or hetero oligomers, thus impairing TGF B signal transduction. Despite evidence showing that Smad3 is more critical than Smad2 in TGF B signaling, the rate of Smad3 mutations in cancer is lower than that of Smad2. Choriocarcinoma tumor cells are TGF B signaling resistant, as well as lacking Smad3 expression. Studies show that reintroducing Smad3 into choriocarcinoma cells is sufficient to increase TIMP 1 (tissue inhibitor of metalloprotease 1) levels, a mediator of TGF B's anti invasive effect, and thus restore TGF B signaling. However, reintroducing Smad3 was not sufficient to rescue the anti invasive effect of TGF B. This suggests that other signaling mechanisms in addition to Smad3 are defective in TGF B resistant choriocarcinoma. This finding is seemingly paradoxical, as TGF B has previously been shown to have neuroprotective effects on Alzheimer's patients. This suggests that some aspect of TGF B signaling is defective, causing TGF B to lose its neuroprotective effects. Research has shown that phosphorylated Smad2 is ectopically localized to cytoplasmic granules rather than the nucleus, in hippocampal neurons of patients with Alzheimer's disease. Specifically, the ectopically located phosphorylated Smad2s were found within amyloid plaques, and attached to neurofibrillary tangles. These data suggest that Smad2 is involved in the development of Alzheimer's disease. Recent studies show that the peptidyl prolyl cis trans isomerase NIMA interacting 1 (PIN1) is involved in promoting the abnormal localization of Smad2. Pin1 was found to co localize with Smad2/3 and phosphorylated tau proteins within the cytoplasmic granules, suggesting a possible interaction. Transfecting Smad2 expressing cells with Pin1 causes proteasome mediated Smad2 degradation, as well as increased association of Smad2 with phosphorylated tau. This feedback loop is bidirectional; Smad2 is also capable of increasing Pin1 mRNA synthesis. Thus, the two proteins could be caught in a "vicious cycle" of regulation. Pin1 causes both itself and Smad2 to be associated in insoluble neurofibrillary tangles, resulting in low levels of both soluble proteins. Smad2 then promotes Pin1 RNA synthesis to try and compensate, which only drives more Smad2 degradation and association with neurofibrillary tangles.

Сигнализация TGF-β/Smad при заболевании почек

Дисрегуляция передачи сигналов TGF B/ Smad является возможным патогенным механизмом хронического заболевания почек. В почках TGF B1 способствует накоплению внеклеточного матрикса (ЭКМ), увеличивая его выработку и ингибируя его деградацию, что характерно для почечного фиброза. Сигнал TGF B1 трансдуцируется R Smads Smad2 и Smad3, оба из которых, как было установлено, являются переэкпрессированными в больных почках. У мышей с нокаутом Smad3 наблюдается снижение прогрессирования почечного фиброза, что свидетельствует о его важности в регулировании заболевания. И наоборот, ингибирование Smad2 в клетках почек (полный нокаут Smad2 является эмбриональным летальным) фактически приводит к более тяжелому фиброзу, что предполагает, что Smad2 действует антагонистично Smad3 в прогрессировании почечного фиброза. В отличие от R Smads, белок Smad7 обычно недостаточно экспрессируется в больных клетках почек. Потеря ингибирования TGF B приводит к увеличению количества активного Smad2/ 3, что способствует прогрессированию почечного фиброза, как описано выше.