Введение

Группа путей передачи сигналов, участвующих в эмбриональном развитии. Сигнальные пути Wnt – это группа путей передачи сигналов, которые начинаются с белков, передающих сигналы в клетку через клеточные поверхностные рецепторы. Название Wnt является портманто, образованным из названий Wingless и Int 1. Сигнальные пути Wnt используют либо межклеточную связь в пределах близлежащих клеток (паракринную), либо связь внутри одной и той же клетки (автокринную). Они высоко эволюционно консервативны у животных, что означает их схожесть у различных видов животных, от плодовых мушек до человека. Неканонический путь полярности планарных клеток регулирует цитоскелет, отвечающий за форму клетки. Неканонический путь Wnt/кальция регулирует содержание кальция внутри клетки. Сигнализация Wnt была впервые идентифицирована благодаря своей роли в канцерогенезе, а затем – в эмбриональном развитии. Эмбриональные процессы, которые она контролирует, включают формирование оси тела, определение судьбы клеток, пролиферацию и миграцию клеток. Эти процессы необходимы для правильного формирования важных тканей, таких как кости, сердце и мышцы. Ее роль в эмбриональном развитии была обнаружена, когда генетические мутации в белках пути Wnt привели к образованию аномальных эмбрионов плодовых мушек. Последующие исследования показали, что гены, ответственные за эти аномалии, также влияют на развитие рака молочной железы у мышей. Сигнализация Wnt также контролирует регенерацию тканей во взрослом костном мозге, коже и кишечнике. Клиническая значимость этого пути была продемонстрирована мутациями, приводящими к различным заболеваниям, включая рак молочной железы и простаты, глиобластому, диабет II типа и другие.

История и этимология

На открытие Wnt-сигнализации повлияли исследования онкогенных (вызывающих рак) ретровирусов. В 1982 году Роэль Нуссе и Гарольд Вармус инфицировали мышей вирусом опухоли молочной железы мыши, чтобы индуцировать мутации в генах мыши и выяснить, какие мутировавшие гены могут вызывать опухоли молочной железы. Они идентифицировали новый протоонкоген мыши, который назвали int1 (интеграция 1). Int1 высоко консервативен у различных видов, включая человека и дрозофилу. Его обнаружение в D. melanogaster привело исследователей к открытию в 1987 году, что ген int1 в Drosophila фактически является уже известным и охарактеризованным геном Drosophila, известным как Wingless (Wg). Дальнейшие исследования привели к обнаружению других генов, связанных с int1; однако, поскольку эти гены были идентифицированы не так, как int1, номенклатура генов int оказалась неадекватной. Таким образом, семейство int/Wingless стало семейством Wnt, а int1 – Wnt1. Название Wnt является комбинацией слов int и Wg и означает «сайт интеграции, связанный с Wingless». Липидное модифицирование всех Wnt белков заключается в пальмитолеоилировании единственного полностью консервативного остатка цистеина. Пальмитолеоилирование необходимо, поскольку оно требуется для связывания Wnt с его белком-переносчиком Wntless (WLS), что обеспечивает его транспорт к плазматической мембране для секреции, а также позволяет белку Wnt связываться со своим рецептором Frizzled. Wnt белки также подвергаются гликозилированию, которое присоединяет углевод для обеспечения правильной секреции. В Wnt-сигнализации эти белки действуют как лиганды для активации различных Wnt-путей посредством паракринных и автокринных механизмов. Эти белки высоко консервативны у разных видов.

Виды | Wnt белки
------- | --------
Homo sapiens | WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16
Mus musculus (Идентичные белки, как у H. sapiens) | Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11, Wnt16
Xenopus | Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11, Wnt11R
Danio rerio | Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11, Wnt16
Drosophila | Wg, DWnt2, DWnt3/5, DWnt4, DWnt6, WntD/DWnt8, DWnt10
Hydra | hywnt1, hywnt5a, hywnt8, hywnt7, hywnt9/10a, hywnt9/10b, hywnt9/10c, hywnt11, hywnt16
C. elegans | mom 2, lin 44, egl 20, cwn 1, cwn 2

Основание

Сигнализация Wnt начинается, когда белок Wnt связывается с N-концевым внеклеточным доменом, богатым цистеином, рецептора семейства Frizzled (Fz). Однако для активации Wnt-сигнализации, помимо взаимодействия между белком Wnt и рецептором Fz, могут потребоваться ко-рецепторы. К ним относятся липопротеиновый рецепторный протеин (LRP) 5/6, рецепторная тирозинкиназа (RTK) и ROR2.

Канонические и неканонические пути

Три наиболее хорошо изученных пути передачи сигналов Wnt – это канонический путь Wnt, неканонический путь полярности планарных клеток и неканонический путь Wnt/кальция. Как следует из их названий, эти пути относятся к одной из двух категорий: канонические или неканонические. Отличие между этими категориями заключается в том, что в каноническом пути участвует белок бета-катенин (β-катенин), а неканонический путь функционирует независимо от него.

Канонический путь

Канонический путь Wnt (или Wnt/β-катенинный путь) – это путь Wnt, вызывающий накопление β-катенина в цитоплазме и его последующую транслокацию в ядро для функционирования в качестве транскрипционного коактиватора факторов транскрипции семейства TCF/LEF. В отсутствие Wnt β-катенин не накапливается в цитоплазме, поскольку комплекс разрушения обычно подвергает его деградации. Этот комплекс разрушения включает следующие белки: аксин, аденоматозный полипозис коли (APC), протеинфосфатаза 2A (PP2A), гликогенсинтазакиназа 3 (GSK3) и казеинкиназа 1α (CK1α). Он деградирует β-катенин, направляя его на убиквитинизацию, которая затем отправляет его в протеасому для расщепления. факторы транскрипции и Парафибромин/Гиракс. Сложность транскрипционного комплекса, формируемого β-катенином, начинает выявляться благодаря новым высокопроизводительным протеомным исследованиям. Однако единой теории того, как β-катенин управляет экспрессией генов-мишеней, все еще нет, и тканеспецифические факторы могут помогать β-катенину в определении его генов-мишеней. Широкий спектр белков, взаимодействующих с β-катенином, затрудняет понимание: β-катенин может быть непосредственно фосфорилирован в Ser552 Akt, что приводит к его диссоциации от межклеточных контактов и накоплению в цитозоле, после чего 14-3-3ζ взаимодействует с β-катенином (pSer552) и усиливает его ядерную транслокацию. Сообщалось, что BCL9 и Pygopus обладают несколькими функциями, независимыми от β-катенина (следовательно, вероятно, независимыми от Wnt-сигнализации).

Неканонические пути

Неканонический путь полярности плоских клеток (PCP) не включает β-катенин. Он не использует LRP 5/6 в качестве корецептора и, как считается, использует NRH1, Ryk, PTK7 или ROR2. Путь PCP активируется при связывании Wnt с Fz и его корецептором. Затем рецептор рекрутирует Dsh, который использует свои PDZ и DIX домены для формирования комплекса с активизатором морфогенеза 1 (DAAM1). Daam1 затем активирует малый G-белок Rho через фактор обмена гуанином. Rho активирует Rho-ассоциированную киназу (ROCK), которая является одним из основных регуляторов цитоскелета. Dsh также образует комплекс с rac1 и опосредует связывание профилина с актином. Rac1 активирует JNK и может также приводить к полимеризации актина. Связывание профилина с актином может приводить к реструктуризации цитоскелета и гаструляции. Неканонический путь Wnt/кальций также не включает β-катенин. Его роль заключается в помощи в регуляции высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭР) для контроля внутриклеточных уровней кальция. Как и другие пути Wnt, при связывании лиганда активированный рецептор Fz непосредственно взаимодействует с Dsh и активирует специфические домены белка Dsh. Домены, участвующие в Wnt/кальциевой сигнализации, – это PDZ и DEP домены. Однако, если PDE активируется, высвобождение кальция из ЭР ингибируется. PDE опосредует это посредством ингибирования PKG, что впоследствии вызывает ингибирование высвобождения кальция. Некоторые доказательства этого были найдены для одного лиганда Wnt (Wnt5A). В клеточных линиях млекопитающих были описаны данные о конвергентном пути Wnt-сигнализации, демонстрирующем интегрированную активацию Wnt/Ca2+ и Wnt/β-катениновой сигнализации для нескольких Wnt-лигандов.

Другие пути

Сигнализация Wnt также регулирует ряд других сигнальных путей, которые изучены менее подробно. Один из таких путей включает взаимодействие между Wnt и GSK3. Во время роста клеток Wnt может ингибировать GSK3 для активации mTOR в отсутствие β-катенина. Однако Wnt также может выступать в качестве отрицательного регулятора mTOR посредством активации опухолевого супрессора TSC2, который регулируется через взаимодействие Dsh и GSK3. Во время миогенеза Wnt использует PA и CREB для активации генов MyoD и Myf5. Wnt также действует совместно с Ryk и Src для регуляции отталкивания нейронов во время аксонального наведения. Wnt регулирует гаструляцию, когда CK1 служит ингибитором Rap1-АТФазы для модуляции цитоскелета в процессе гаструляции. Дальнейшая регуляция гаструляции достигается, когда Wnt использует ROR2 вместе с CDC42 и JNK для регуляции экспрессии PAPC. Dsh также может взаимодействовать с aPKC, Pa3, Par6 и LGl для контроля полярности клеток и развития микротрубочкового цитоскелета. Хотя эти пути пересекаются с компонентами, связанными с сигнализацией PCP и Wnt/кальцием, они считаются различными, поскольку вызывают разные ответы. Например, белки Wnt подвергаются палмитоилированию. Белок Porcupine опосредует этот процесс, то есть он помогает регулировать секрецию лиганда Wnt, определяя, когда он полностью сформирован. Секреция дополнительно контролируется такими белками, как GPR177 (wntless) и evenness interrupted, а также комплексами, такими как ретромерный комплекс. После секреции лиганд может быть предотвращен от достижения своего рецептора путем связывания с белками, такими как стабилизаторы Dally и glypican 3 (GPC3), которые ингибируют диффузию. В раковых клетках как гепарансульфатные цепи, так и основной белок GPC3 участвуют в регуляции связывания и активации Wnt для пролиферации клеток. Wnt распознает гепарансульфатную структуру на GPC3, содержащую IdoA2S и GlcNS6S, а 3-O-сульфатирование в GlcNS6S3S усиливает связывание Wnt с гепарансульфатом глипикана. Было установлено, что богатый цистеином домен в N-доле GPC3 формирует гидрофобную бороздку для связывания Wnt, включая фенилаланин 41, который взаимодействует с Wnt. Блокирование Wnt-связывающего домена с помощью нанотела HN3 может ингибировать активацию Wnt. Секретируются связанные с Frizzled белки (SFRP), Cerberus, Frzb, Wise, SOST и Naked cuticle. Они являются ингибиторами Wnt-сигнализации. Однако другие молекулы также действуют как активаторы. Norrin и R-Spondin2 активируют Wnt-сигнализацию в отсутствие лиганда Wnt. Взаимодействия между Wnt-сигнальными путями также регулируют Wnt-сигнализацию. Как упоминалось ранее, Wnt/кальциевый путь может ингибировать TCF/β-катенин, предотвращая каноническую сигнализацию Wnt-пути.

Эмбриональное развитие

Сигнализация Wnt играет критическую роль в эмбриональном развитии. Она функционирует как у позвоночных, так и у беспозвоночных, включая человека, лягушек, данио рерио, C. elegans, Drosophila и других. Впервые она была обнаружена в определении полярности сегментов у Drosophila, где она помогает установить передне-заднюю полярность. Она вовлечена и в другие процессы развития. Как показывает её функция у Drosophila, она играет ключевую роль в формировании осей тела, в частности передне-задней и спинно-вентральной осей. Она участвует в индукции дифференцировки клеток, стимулируя формирование важных органов, таких как легкие и яичники. Wnt также обеспечивает развитие этих тканей посредством правильной регуляции пролиферации и миграции клеток. Функции сигнализации Wnt можно разделить на формирование осей, определение судьбы клеток, пролиферацию клеток и миграцию клеток.

Оси моделирования

В раннем развитии эмбриона формирование основных осей тела является важнейшим шагом в установлении общего плана строения организма. Эти оси включают передне-заднюю, спинно-брюшную (дорзо-вентральную, DV) и правую-левую. Сигнализация Wnt вовлечена в формирование передне-задней и спинно-брюшной осей. Сигнальная активность Wnt в развитии передне-задней оси наблюдается у млекопитающих, рыб и лягушек. У млекопитающих примитивная полоска и окружающие ткани производят морфогенные соединения – Wnt, BMP, FGF, Nodal и ретиноевую кислоту – для установления заднего региона на поздней стадии гаструляции. Эти белки формируют градиенты концентрации. Области с наибольшей концентрацией определяют задний регион, а области с наименьшей – передний. У рыб и лягушек β-катенин, продуцируемый канонической Wnt-сигнализацией, вызывает образование организующих центров, которые вместе с BMP стимулируют формирование задней части тела. Участие Wnt в формировании спинно-брюшной оси проявляется в активности организатора Шпемана, который определяет спинную область. Каноническая Wnt-сигнализация, индуцируя продукцию β-катенина, вызывает образование этого организатора через активацию генов twin и siamois. Wnt-сигнализация также участвует в формировании осей отдельных частей тела и систем органов на более поздних этапах развития. У позвоночных градиенты морфогенной сигнализации sonic hedgehog (Shh) и Wnt устанавливают спинно-брюшную ось центральной нервной системы в процессе осевой организации нервной трубки. Высокий уровень Wnt-сигнализации определяет спинную область, а высокий уровень Shh-сигнализации – брюшную. Wnt участвует в формировании спинно-брюшной оси центральной нервной системы, влияя на наведение аксонов. Белки Wnt направляют аксоны спинного мозга в передне-заднем направлении. Wnt также участвует в формировании спинно-брюшной оси конечностей. В частности, Wnt7a способствует формированию спинного рисунка развивающейся конечности.

Спецификация судьбы клеток

Спецификация клеточной судьбы или дифференциация клеток – это процесс, в ходе которого недифференцированные клетки становятся более специализированными. Wnt-сигнализация индуцирует дифференциацию плюрипотентных стволовых клеток в прогенераторные клетки мезодермы и эндодермы. Эти клетки-предшественники далее дифференцируются в такие типы клеток, как эндотелиальные, кардиальные и линии гладких мышц сосудов. Wnt-сигнализация индуцирует образование крови из стволовых клеток. В частности, Wnt3 приводит к образованию клеток мезодермального происхождения с гематопоэтическим потенциалом. Wnt1 подавляет нейронную дифференциацию и является ключевым фактором самообновления нейронных стволовых клеток. Это способствует регенерации клеток нервной системы, что является дополнительным доказательством его роли в стимуляции пролиферации нейронных стволовых клеток. Ингибиторы Wnt малых молекул регулярно используются для получения кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток.

Пролиферация клеток

Для того чтобы обеспечить массовую дифференциацию клеток, необходимую для формирования специфических клеточных тканей различных организмов, должна происходить пролиферация и рост эмбриональных стволовых клеток. Этот процесс опосредован канонической Wnt-сигнализацией, которая повышает уровень ядерного и цитоплазматического β-катенина. Увеличение уровня β-катенина может инициировать транскрипционную активацию белков, таких как циклин D1 и c-Myc, которые контролируют переход из фазы G1 в S фазу клеточного цикла. Вход в S-фазу вызывает репликацию ДНК и, в конечном итоге, митоз, которые обеспечивают пролиферацию клеток. Это увеличение пролиферации напрямую связано с дифференцировкой клеток, поскольку стволовые клетки одновременно пролиферируют и дифференцируются. Это обеспечивает общий рост и развитие специфических тканевых систем в процессе эмбрионального развития. Это наглядно демонстрируется на примере кровеносной системы, где Wnt3a стимулирует пролиферацию и расширение гемопоэтических стволовых клеток, необходимых для образования красных кровяных телец. Биохимия раковых стволовых клеток несколько отличается от биохимии других опухолевых клеток. Эти так называемые Wnt-зависимые клетки используют и нуждаются в постоянной стимуляции Wnt-пути для поддержания их неконтролируемого роста, выживания и миграции. При раке Wnt-сигнализация может стать независимой от обычных стимулов из-за мутаций в дочерних онкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые постоянно активируются, даже если нормальный рецептор не получил сигнал. β-катенин связывается с факторами транскрипции, такими как белок TCF4, и в комбинации эти молекулы активируют необходимые гены. LF3 эффективно ингибирует это связывание in vitro, в клеточных линиях, и снижает рост опухоли в моделях на мышах. Он предотвращал репликацию и снижал способность клеток к миграции, не оказывая влияния на здоровые клетки. После лечения раковые стволовые клетки не обнаруживались. Это открытие стало результатом "рациональной разработки лекарств" с использованием технологий AlphaScreens и ELISA.

Миграция клеток

Миграция клеток во время эмбрионального развития обеспечивает формирование осей тела, образование тканей, индукцию конечностей и ряд других процессов. Сигнализация Wnt способствует реализации этого процесса, особенно во время конвергентного расширения. Для правильного протекания конвергентного расширения в процессе гаструляции необходима сигнализация как по пути Wnt PCP, так и по каноническому пути Wnt. Конвергентное расширение дополнительно регулируется Wnt/кальциевым путем, который блокирует конвергентное расширение при активации. Сигнализация Wnt также индуцирует миграцию клеток на более поздних стадиях развития, контролируя миграционное поведение нейробластов, клеток нервного гребня, миоцитов и трахеальных клеток. Сигнализация Wnt участвует и в другом ключевом процессе миграции, известном как эпителиально-мезенхимальный переход (EMT). Этот процесс позволяет эпителиальным клеткам трансформироваться в мезенхимальные, освобождаясь от прикрепления к ламинину. Он включает в себя снижение экспрессии кадеринов, что позволяет клеткам отсоединяться от ламинина и мигрировать. Сигнализация Wnt является индуктором EMT, особенно в развитии молочной железы.

Чувствительность к инсулину

Инсулин – пептидный гормон, участвующий в поддержании гомеостаза глюкозы в определенных организмах. Он способствует увеличению экспрессии транспортеров глюкозы в клеточной мембране, что приводит к усилению поглощения глюкозы из кровотока. Этот процесс частично опосредован активацией Wnt/β-катенина, что может повысить чувствительность клеток к инсулину. В частности, Wnt10b – это белок семейства Wnt, который увеличивает эту чувствительность в клетках скелетных мышц.

Рак

С момента своего первоначального открытия сигнализация Wnt ассоциируется с раком. Когда Wnt1 был обнаружен, он был впервые идентифицирован как протоонкоген в мышиной модели рака молочной железы. Тот факт, что Wnt1 является гомологом Wg, указывает на его участие в эмбриональном развитии, которое часто требует быстрого деления и миграции клеток. Нарушение регуляции этих процессов может приводить к развитию опухолей посредством избыточной пролиферации клеток. Активность канонического Wnt-пути вовлечена в развитие доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы. Роль Wnt-пути в химиорезистентности опухолей также хорошо изучена, равно как и его роль в поддержании отдельной субпопуляции раковых инициаторных клеток. Его присутствие выявляется повышенным уровнем β-катенина в ядре и/или цитоплазме, что можно обнаружить с помощью иммуногистохимического окрашивания и вестерн-блоттинга. Повышенная экспрессия β-катенина коррелирует с неблагоприятным прогнозом у пациентов с раком молочной железы. Это накопление может быть обусловлено такими факторами, как мутации в β-катенине, дефекты в комплексе деградации β-катенина, чаще всего мутации в структурно неорганизованных областях APC, переэкспрессия лигандов Wnt, потеря ингибиторов и/или снижение активности регуляторных путей (таких как Wnt/кальциевый путь). Опухоли молочной железы могут метастазировать из-за участия Wnt в эпителиально-мезенхимальном переходе (EMT). Исследования метастазирования базальноподобного рака молочной железы в легкие показали, что подавление сигнализации Wnt/β-катенина может предотвратить EMT, что, в свою очередь, может ингибировать метастазирование. Сигнализация Wnt имплицирована в развитии других видов рака, а также в десмоидном фиброматозе. Изменения экспрессии CTNNB1, гена, кодирующего β-катенин, могут быть измерены при раке молочной железы, колоректальном раке, меланоме, раке предстательной железы, легких и других онкологических заболеваниях. Увеличение экспрессии Wnt-лигандных белков, таких как Wnt1, Wnt2 и Wnt7A, наблюдалось при развитии глиобластомы, рака пищевода и рака яичников соответственно. Другие белки, вызывающие различные типы рака при нарушении их нормальной функции, включают ROR1, ROR2, SFRP4, Wnt5A, WIF1 и белки семейства TCF/LEF. Сигнализация Wnt также вовлечена в патогенез костных метастазов при раке молочной железы и простаты, при этом исследования указывают на дискретные состояния включения и выключения. Wnt снижается во время стадии спячки под действием аутокринного DKK1, чтобы избежать иммунного надзора, а также во время стадии распространения под действием внутриклеточного Dact1. В то же время Wnt активируется на ранней фазе роста под действием E-селектина. Связь между PGE2 и Wnt предполагает, что увеличение PGE2, связанное с хроническим воспалением, может приводить к активации Wnt-пути в различных тканях, что, в свою очередь, вызывает канцерогенез. Сигнализация Wnt является мощным активатором митохондриального биогенеза. Это приводит к увеличению продукции реактивных форм кислорода (ROS), известных своим повреждающим действием на ДНК и клетки. Это ROS-индуцированное повреждение имеет значение, поскольку может вызывать острую печеночную инсулинорезистентность или инсулинорезистентность, вызванную травмой. Мутации в транскрипционных факторах, связанных с сигнализацией Wnt, таких как TCF7L2, связаны с повышенной восприимчивостью.