Введение

Мультипротеиновый никельсодержащий комплекс, гидролизующий мочевину.

Уреазы функционально относятся к суперсемейству амидогидролаз и фосфотриэстераз. Уреазы обнаружены в многочисленных бактериях, грибах, водорослях, растениях и некоторых беспозвоночных, а также в почвах в качестве почвенного фермента. Это никельсодержащие металлоэнзимы с высокой молекулярной массой. Эти ферменты катализируют гидролиз мочевины до углекислого газа и аммиака:
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

Гидролиз мочевины происходит в два этапа. На первом этапе образуются аммиак и карбаминовая кислота. Карбамат спонтанно и быстро гидролизуется до аммиака и угольной кислоты. Активность уреазы повышает pH окружающей среды, поскольку образуется аммиак, являющийся основанием.

История

Его активность была впервые выявлена в 1876 году Фредериком Альфонсом Мускулсом как растворимый фермент. В 1926 году Джеймс Б. Самнер показал, что уреаза является белком, изучив ее кристаллизованную форму. Работа Самнера была первой демонстрацией того, что белок может функционировать как фермент, и в конечном итоге привела к признанию того, что большинство ферментов на самом деле являются белками. Уреаза была первым кристаллизованным ферментом. За эту работу Самнер был удостоен Нобелевской премии по химии в 1946 году. Кристаллическая структура уреазы была впервые определена П. А. Карплюсом в 1995 году. Активация in vitro также достигается с использованием марганца и кобальта вместо никеля. Соли свинца являются ингибиторами. Молекулярная масса составляет 480 кДа или 545 кДа для уреазы из бобов (масса, рассчитанная на основе аминокислотной последовательности). Молекула содержит 840 аминокислот, из которых 90 – остатки цистеина. Оптимальный pH – 7,4, оптимальная температура – 60 °C. Субстратами являются мочевина и гидроксимочевина. Бактериальные уреазы состоят из трех различных субъединиц: одной большой каталитической (α 60–76 кДа) и двух малых (β 8–21 кДа, γ 6–14 кДа), обычно образующих тримеры (αβγ)3 со стехиометрией и двухкратной симметрией (следует отметить, что изображение выше показывает структуру асимметричной единицы, то есть одну треть истинного биологического комплекса). Это ферменты, богатые цистеином, что приводит к молекулярным массам фермента в диапазоне от 190 до 300 кДа. Они состоят из повторяющихся α-β-субъединиц, каждая пара которых содержит активный сайт, в общей сложности 12 активных сайтов. Наличие уреазы используется в диагностике видов Helicobacter. Все бактериальные уреазы являются исключительно цитоплазматическими, за исключением тех, что содержатся в Helicobacter pylori, которые, наряду с цитоплазматической активностью, проявляют активность вне клеток-хозяев. В отличие от этого, все растительные уреазы являются цитоплазматическими.

Активность

Ккат/Км уреазы в процессе переработки мочевины в 1014 раз превышает скорость некатализируемой реакции элиминирования мочевины. Исследования рентгеновской абсорбционной спектроскопии (XAS) уреаз Canavalia ensiformis (бобов бархата), Klebsiella aerogenes и Sporosarcina pasteurii (ранее известной как Bacillus pasteurii). В уреазе Sporosarcina pasteurii «створка» была обнаружена в открытой конформации, в то время как ее закрытая конформация, по-видимому, необходима для протекания реакции. При сравнении α-субъединицы уреазы Helicobacter pylori и других бактериальных уреаз соответствуют уреазам бобов бархата. Реакция начинается с нуклеофильной атаки карбонильным кислородом молекулы мочевины на 5-координатный Ni (Ni 1). Слабо координированный лиганд воды замещается на его месте. Одиночная пара электронов от одного из атомов азота в молекуле мочевины образует двойную связь с центральным атомом углерода, а образующийся NH2− координированного субстрата взаимодействует с находящейся поблизости положительно заряженной группой. Блейкли и Зернер предположили, что эта группа является карбоксилат-ионом, хотя депротонированные карбоксилаты несут отрицательный заряд. Гидроксидный лиганд на 6-координатном Ni депротонируется основанием. Карбонильный углерод впоследствии подвергается атаке электроотрицательного кислорода. Пара электронов из азотно-углеродной двойной связи возвращается к азоту, нейтрализуя заряд на нем, в то время как углерод, имеющий 4 координаты, принимает промежуточную тетраэдрическую ориентацию. Разложению этого промежуточного соединения способствует сульфгидрильная группа цистеина, расположенного вблизи активного центра. Атом водорода образует связь с одним из атомов азота, разрывая его связь с углеродом и высвобождая молекулу. Одновременно разрывается связь между кислородом и 6-координатным никелем. Это оставляет карбамат-ион, координированный с 5-координатным Ni, который затем замещается молекулой воды, регенерируя фермент. Образовавшийся карбамат затем спонтанно разлагается с образованием еще одной молекулы аммиака и угольной кислоты.

Хаузингер/Карплюс

Механизм, предложенный Хаузингером и Карплюсом, пытается пересмотреть некоторые проблемы, выявленные в механизме Блейкли и Зернера, и фокусируется на положении боковых цепей, формирующих карман связывания мочевины. Хаузингер и Карплюс предлагают схему обратной протонации, в которой протонированная форма лиганда His320 выступает в роли общей кислоты, а вода, связанная с Ni2, уже находится в депротонированном состоянии. Этот механизм является одним из наиболее современных и общепринятых представлений о работе уреазы и основывается главным образом на различных функциях двух ионов никеля в активном центре.

Инфекционные камни

Инфекционно вызванные мочевые камни представляют собой смесь струвита (MgNH4PO4•6H2O) и карбоната апатита [Ca10(PO4)6•CO3].

Уреас при печеночной энцефалопатии / печеночной коме

Исследования показали, что Helicobacter pylori, наряду с циррозом печени, вызывает печеночную энцефалопатию и печеночную кому. Helicobacter pylori выделяет микробиальные уреазы в желудок. Уреаза гидролизует мочевину, образуя аммиак и угольную кислоту. Поскольку бактерии локализуются в желудке, образующийся аммиак легко поступает в кровоток из просвета желудка. Это было подтверждено снижением кровотечений из язв и уменьшением частоты их рецидивов после эрадикации возбудителя.

Возникновение и применение в сельском хозяйстве

Мочевина встречается в природе и вносится искусственно, составляя более половины всех синтетических азотных удобрений, используемых в мире. Считается, что интенсивное использование мочевины способствует эвтрофикации, несмотря на то, что наблюдается быстрое преобразование мочевины микробиальными уреазами, и, следовательно, она обычно не накапливается. Активность уреазы в окружающей среде часто измеряется как индикатор состояния микробных сообществ. В отсутствие растений активность уреазы в почве обычно связывают с гетеротрофными микроорганизмами, хотя было показано, что некоторые хемоавтотрофные аммонийокисляющие бактерии способны расти на мочевине как единственном источнике углерода, азота и энергии.

Ингибирование в удобрениях

Ингибирование уреазы – важная задача в сельском хозяйстве, поскольку быстрое разложение удобрений на основе мочевины неэффективно и наносит вред окружающей среде. Фенилфосфородиамидат и N-(н-бутил)тиофосфорная триамида – два таких ингибитора.

Биоминерализация

Способствуя образованию карбоната кальция, уреазы обладают потенциалом для применения в процессах биоминерализации. В частности, микробиологически индуцированное образование карбоната кальция может быть использовано в производстве биобетона.

Неферментативное действие

Помимо действия в качестве фермента, некоторые уреазы (особенно растительные) обладают дополнительными эффектами, сохраняющимися даже при нарушении каталитической функции. К ним относятся энтомотоксичность, подавление роста грибов, нейротоксичность у млекопитающих, стимуляция эндоцитоза и продукция воспалительных эйкозаноидов у млекопитающих, а также индукция хемотаксиса у бактерий. Эти эффекты могут являться частью защитного механизма.

Ингибиторы

Известен широкий спектр ингибиторов уреазы, принадлежащих к различным структурным семействам. Ингибирование уреазы представляет интерес не только для сельского хозяйства, но и для медицины, поскольку такие патогены, как H. pylori, продуцируют уреазу как механизм выживания. Известные структурные классы ингибиторов включают:

Аналоги мочевины, среди которых наиболее сильными являются тиомочевины, например, 1-(4-хлорфенил)-3-пальмитоилтиомочевина. Фосфорамидаты, наиболее часто используемые в сельском хозяйстве (см. выше). Гидрохинон и хиноны. В медицине особый интерес представляют хинолоны, которые уже являются широко используемым классом антибиотиков. Некоторые растительные метаболиты также являются ингибиторами уреазы, например, аллицин. Они обладают потенциалом как экологически безопасные добавки к удобрениям, так и натуральные лекарственные средства.

Экстракция

Впервые выделен в виде кристаллов в 1926 году Самнер с использованием солюбилизации ацетоном и центрифугирования. Современная биохимия повысила спрос на уреазу. Мука из бобов, семена арбуза и семена гороха оказались полезными источниками уреазы.