Активный центр фермента

Введение

В биологии и биохимии активный центр – это область фермента, где молекулы субстрата связываются и происходит химическая реакция. Активный центр состоит из аминокислотных остатков, образующих временные связи с субстратом (участок связывания) и остатков, катализирующих реакцию этого субстрата (каталитический участок). Хотя активный центр занимает лишь около 10–20% объема фермента, он является наиболее важной его частью, поскольку непосредственно катализирует химическую реакцию. Обычно он состоит из трех-четырех аминокислот, в то время как другие аминокислоты в белке необходимы для поддержания его третичной структуры. Каждый активный центр эволюционировал таким образом, чтобы быть оптимальным для связывания с конкретным субстратом и катализа конкретной реакции, что обеспечивает высокую специфичность. Эта специфичность определяется расположением аминокислот в активном центре и структурой субстратов. Иногда для выполнения своей функции ферментам также необходимо связываться с кофакторами. Активный центр обычно представляет собой углубление или карман фермента, который может располагаться в глубоком туннеле внутри фермента или на границе между субъединицами мультимерных ферментов. Активный центр может многократно катализировать реакцию, поскольку остатки не изменяются в конце реакции (они могут изменяться в ходе реакции, но восстанавливаются к концу). Это достигается путем снижения энергии активации реакции, благодаря чему большее количество субстратов получает достаточно энергии для ее протекания.

Обязательное место

Обычно молекула фермента имеет только один активный центр, и этот активный центр подходит для одного конкретного типа субстрата. Активный центр содержит связывающий участок, который связывает субстрат и ориентирует его для катализа. Ориентация субстрата и его тесное расположение относительно активного центра настолько важны, что в некоторых случаях фермент может продолжать функционировать должным образом, даже если все остальные его части мутируют и теряют свою функцию. Взаимодействие между активным центром и субстратом изначально нековалентное и временное. Существует четыре важных типа взаимодействий, которые удерживают субстрат в определенной ориентации и формируют комплекс фермент-субстрат (комплекс ES): водородные связи, взаимодействия Ван-дер-Ваальса, гидрофобные взаимодействия и электростатические взаимодействия. Распределение зарядов на субстрате и в активном центре должно быть комплементарным, то есть все положительные и отрицательные заряды должны компенсировать друг друга. В противном случае возникнет сила отталкивания, разъединяющая их. Активный центр обычно содержит неполярные аминокислоты, хотя иногда могут встречаться и полярные аминокислоты. У большинства ферментов активные центры глубоко погружены в структуру белка и доступны субстрату через доступные каналы.

Гипотеза замка и ключа

Эта концепция была предложена химиком 19-го века Эмилем Фишером. Он предположил, что активный центр и субстрат – это две стабильные структуры, которые идеально соответствуют друг другу без каких-либо дальнейших модификаций, подобно тому, как ключ подходит к замку. Если субстрат идеально связывается со своим активным центром, взаимодействия между ними будут наиболее прочными, что приведет к высокой каталитической эффективности. Со временем стали проявляться ограничения этой модели. Например, конкурентный ингибитор фермента метилглюкозид может прочно связываться с активным центром 4-альфа-глюканотрансферазы и идеально в него вписываться. Однако 4-альфа-глюканотрансфераза не активна в отношении метилглюкозида, и перенос гликозила не происходит. Гипотеза «замок и ключ» не может объяснить это, поскольку она предсказывала бы высокую эффективность переноса гликозила метилглюкозидом из-за его прочного связывания. Помимо конкурентного ингибирования, эта теория не может объяснить механизм действия неконкурентных ингибиторов, поскольку они не связываются с активным центром, но тем не менее влияют на каталитическую активность.

Гипотеза индуцированного приспособления

Теория связывания фермента с субстратом, предложенная Дэниелом Кошланд, заключается в том, что активный центр и связывающая часть субстрата не являются идеально комплементарными. Модель индуцированной подгонки является развитием модели «ключ-замок» и предполагает, что активный центр гибкий и изменяет свою форму до тех пор, пока субстрат полностью не свяжется с ним. Эта модель аналогична тому, как человек надевает перчатку: перчатка меняет форму, чтобы плотно облегать руку. Фермент изначально имеет конформацию, которая привлекает его субстрат. Поверхность фермента гибкая, и только подходящий субстрат может индуцировать взаимодействие, приводящее к катализу. После связывания субстрата могут происходить конформационные изменения. После завершения реакции продукты отсоединяются от фермента, и активный центр возвращается к своей исходной форме. Эта гипотеза подтверждается наблюдением, что во время катализа весь белковый домен может смещаться на несколько нанометров. Такое движение поверхности белка может создавать микросреду, благоприятную для катализа.

Типы нековалентных взаимодействий

Электростатическое взаимодействие: В водной среде противоположно заряженные группы в боковых цепях аминокислот в активном центре и субстратах притягиваются друг к другу, что и называется электростатическим взаимодействием. Например, когда карбоновая кислота (R COOH) диссоциирует на ионы RCOO− и H+, ион COO− будет притягиваться к положительно заряженным группам, таким как протонированная гуанидиновая группа аргинина. Водородная связь: Водородная связь – это специфический тип диполь-дипольного взаимодействия между частично положительным атомом водорода и частично отрицательным донором электронных пар, таких как кислород, фтор и азот. Прочность водородной связи зависит от химической природы и геометрического строения взаимодействующих групп. Силы Ван-дер-Ваальса: Силы Ван-дер-Ваальса возникают между группами с противоположными зарядами из-за временного неравномерного распределения электронов в каждой группе. Если электроны сосредоточены на одном полюсе группы, этот конец становится отрицательным, а противоположный – положительным. Хотя отдельные силы Ван-дер-Ваальса слабы, суммарный эффект множества таких взаимодействий между активным центром и субстратом может быть значительным. Гидрофобное взаимодействие: Неполярные гидрофобные группы в водной среде стремятся к агрегации, избегая контакта с полярным растворителем. Эти группы обычно содержат длинные углеводородные цепи и не взаимодействуют с молекулами воды. При растворении в воде молекула белка сворачивается, образуя шарообразную структуру, с гидрофильными группами на поверхности и гидрофобными группами, расположенными в центре.

Каталитический участок

После того, как субстрат свяжется и ориентируется в активном центре, может начаться катализ. Аминокислотные остатки каталитического центра обычно расположены очень близко к месту связывания, и некоторые из них могут выполнять двойную роль, участвуя как в связывании, так и в катализе. Каталитические остатки активного центра взаимодействуют с субстратом, снижая энергию активации реакции и тем самым ускоряя ее протекание. Они делают это посредством различных механизмов, включая приближение реагентов, нуклеофильный/электрофильный катализ и кислотно-основной катализ. Эти механизмы будут рассмотрены ниже.

Приближение реактивного вещества

Во время ферментативной каталитической реакции субстрат и активный центр сближаются в непосредственной близости. Этот подход преследует различные цели. Во-первых, при связывании субстратов в активном центре их эффективная концентрация значительно возрастает по сравнению с концентрацией в растворе. Это означает, что увеличивается и число молекул субстрата, участвующих в реакции. Этот процесс также снижает энергию десольватации, необходимую для протекания реакции. В растворе молекулы субстрата окружены молекулами растворителя, и для их замещения молекулами фермента и установления контакта с субстратом требуется энергия. Поскольку объемные молекулы могут быть исключены из активного центра, этот энергетический расход можно минимизировать. Далее, активный центр предназначен для переориентации субстрата с целью снижения энергии активации реакции. После связывания ориентация субстрата фиксируется в состоянии с высокой энергией и может перейти к следующему этапу. Кроме того, связывание благоприятствуется энтропией, поскольку энергетические затраты, связанные с реакцией в растворе, в значительной степени устраняются, так как растворитель не может проникнуть в активный центр. В конечном итоге, активный центр может изменять молекулярную орбиталь субстрата, приводя ее в подходящую ориентацию для снижения энергии активации, как и в случае молекул с большим количеством вращающихся связей (хотя это может быть побочным эффектом размера). Когда растворитель исключается из активного центра, менее гибкие белки демонстрируют более длительное время пребывания. Увеличение числа водородных связей, защищенных от растворителя, также снижает вероятность отсоединения. Если ВИЧ-протеаза блокируется, вирусная частица теряет функциональность и не может инфицировать пациентов. Поскольку она играет ключевую роль в репликации вируса и отсутствует в здоровых клетках человека, она является идеальной мишенью для разработки лекарственных препаратов. ВИЧ-протеаза принадлежит к семейству аспартических протеаз и имеет схожий механизм действия. Сначала остаток аспартата активирует молекулу воды, превращая ее в нуклеофил. Затем он атакует карбонильную группу в пептидной связи (NH CO), образуя тетраэдрический промежуточный комплекс. Атом азота в этом комплексе принимает протон, формируя амидную группу, а последующая перегруппировка приводит к разрыву связи между ним и промежуточным комплексом, образуя два продукта. Ингибиторы обычно содержат негидролизуемые группы гидроксиэтилена или гидроксиэтиламина, имитирующие тетраэдрический промежуточный комплекс. Поскольку они имеют сходную структуру и электростатическое распределение с переходным состоянием субстратов, они могут помещаться в активный центр, но не подвергаются расщеплению, что предотвращает гидролиз.

During enzyme catalytic reaction, the substrate and active site are brought together in a close proximity. This approach has various purposes. Firstly, when substrates bind within the active site the effective concentration of it significantly increases than in solution. This means the number of substrate molecules involved in the reaction is also increased. This process also reduces the desolvation energy required for the reaction to occur. In solution substrate molecules are surrounded by solvent molecules and energy is required for enzyme molecules to replace them and contact with the substrate. Since bulk molecules can be excluded from the active site this energy output can be minimised. Next, the active site is designed to reorient the substrate to reduce the activation energy for the reaction to occur. The alignment of the substrate, after binding, is locked in a high energy state and can proceed to the next step. In addition, this binding is favoured by entropy as the energy cost associated with solution reaction is largely eliminated since solvent cannot enter active site. In the end, the active site may manipulate the Molecular orbital of the substrate into a suitable orientation to reduce activation energy. as do those with more rotatable bonds (although this may be a side effect of size). When the solvent is excluded from the active site, less flexible proteins result in longer residence times. More hydrogen bonds shielded from the solvent also decrease unbinding. If HIV protease is switched off the virion particle will lose function and cannot infect patients. Since it is essential in viral replication and is absent in healthy human, it is an ideal target for drug development. HIV protease belongs to aspartic protease family and has a similar mechanism. Firstly the aspartate residue activates a water molecule and turns it into a nucleophile. Then it attacks the carbonyl group within the peptide bond (NH CO) to form a tetrahedral intermediate. The nitrogen atom within the intermediate receives a proton, forming an amide group and subsequent rearrangement leads to the breakdown of the bond between it and the intermediate and forms two products. Inhibitors usually contain a nonhydrolyzable hydroxyethylene or hydroxyethylamine groups that mimic the tetrahedral intermediate. Since they share a similar structure and electrostatic arrangement to the transition state of substrates they can still fit into the active site but cannot be broken down, so hydrolysis cannot occur.

Неконкурентный ингибитор: стрихнин

Стрихнин – это нейротоксин, вызывающий смерть путем воздействия на нервы, контролирующие сокращение мышц и затрудняющие дыхание. Импульс передается между синапсами посредством нейромедиатора, называемого ацетилхолином. Он высвобождается в синаптическую щель между нервными клетками и связывается с рецепторами в постсинаптической клетке. Затем генерируется потенциал действия и передается через постсинаптическую клетку, запуская новый цикл. Глицин способен ингибировать активность рецепторов нейромедиаторов, поэтому для запуска потенциала действия требуется большее количество ацетилхолинэстеразы. Это обеспечивает строгий контроль генерации нервных импульсов. Однако этот контроль нарушается при добавлении стрихнина. Он ингибирует глициновые рецепторы (хлоридный канал), и значительно более низкая концентрация нейромедиатора может вызвать потенциал действия. Нервы теперь постоянно передают сигналы, вызывая чрезмерное сокращение мышц, что приводит к асфиксии и смерти.

Необратимый ингибитор: диизопропил фторфосфат

Диизопропил фторифосфат (DIFP) — необратимый ингибитор, блокирующий действие серинпротеаз. При связывании с ферментом происходит реакция нуклеофильного замещения, в результате которой высвобождается одна молекула фтористого водорода. OH-группа в активном центре выступает в роли нуклеофила, атакующего фосфор в DIFP, что приводит к образованию тетраэдрического промежуточного соединения и высвобождению протона. Затем разрывается связь P–F, один электрон переходит к атому фтора, и он покидает промежуточное соединение в виде F⁻-аниона. Этот анион соединяется с протоном в растворе, образуя одну молекулу HF. Между активным центром и DIFP образуется ковалентная связь, в результате чего боковая цепь серина становится недоступной для субстрата.

В исследованиях лекарств

Определение активных центров имеет решающее значение в процессе разработки лекарственных препаратов. Трехмерная структура фермента анализируется для идентификации аминокислотных остатков активного центра и разработки препаратов, способных в него поместиться. Протеолитические ферменты являются мишенями для некоторых лекарств, таких как ингибиторы протеаз, включая препараты против СПИДа и гипертонии. Эти ингибиторы протеаз связываются с активным центром фермента и блокируют взаимодействие с естественными субстратами. Важным фактором в разработке лекарственного препарата является прочность связывания между активным центром и ингибитором фермента. Если фермент, обнаруженный у бактерий, значительно отличается от человеческого фермента, то можно разработать ингибитор, специфичный для этой бактерии, не повреждая человеческий фермент. Если определенный тип фермента присутствует только в одном организме, его ингибитор можно использовать для избирательного уничтожения этого организма. Для помощи в разработке новых лекарств, таких как ингибиторы ферментов, можно картировать активные центры. Это включает описание размера активного центра, количества и свойств субсайтов, а также детали взаимодействия при связывании.

Применение ингибиторов ферментов

Пример Механизм действия Антибактериальный агент Пенициллин Бактериальная клеточная стенка состоит из пептидогликана. Во время роста бактерий существующие поперечные связи пептидогликановых волокон разрушаются, что позволяет новым мономерам клеточной стенки интегрироваться в нее. Пенициллин действует, ингибируя транспептидазу, которая необходима для формирования поперечных связей, в результате чего клеточная стенка ослабевает и разрушается из-за тургорного давления. Противогрибковый агент Азол Эргостерол – это стерол, формирующий клеточную мембрану грибов. Азол может ингибировать его биосинтез, ингибируя ланостерол-14α-деметилазу, в результате чего не образуется новый эргостерол, а в клетке накапливается вредный 14α-ланостерол. Кроме того, азол может генерировать активные формы кислорода. Антивирусный агент Саквинавир ВИЧ-протеаза необходима для расщепления полипротеина Gag Pol на 3 отдельных белка, чтобы они могли функционировать должным образом и начать процесс упаковки вируса. Ингибиторы ВИЧ-протеазы, такие как саквинавир, ингибируют ее, в результате чего не образуется новых зрелых вирусных частиц. Инсектициды Физостигмин В нервной системе животных ацетилхолинестераза необходима для расщепления нейромедиатора ацетилхолина на ацетат и холин. Физостигмин связывается с ее активным центром и ингибирует ее, в результате чего нервные импульсы не могут передаваться по нервам. Это приводит к гибели насекомых, поскольку они теряют контроль над функцией мышц и сердца. Гербициды Циклогександион Циклогександион воздействует на ацетил-КоА-карбоксилазу, которая участвует в первой стадии синтеза жиров: АТФ-зависимое карбоксилирование ацетил-КоА в малонил-КоА. Липиды важны для формирования клеточной мембраны.

Аллостерические участки

Аллостерический сайт — это участок на ферменте, не связанный с его активным центром, к которому может присоединяться эффекторная молекула. Это взаимодействие представляет собой еще один механизм регуляции ферментативной активности. Аллостерическая модификация обычно происходит в белках, состоящих из нескольких субъединиц. Аллостерические взаимодействия часто встречаются в метаболических путях и полезны тем, что позволяют одному этапу реакции регулировать другой. Они обеспечивают ферменту возможность различных молекулярных взаимодействий, помимо высокоспецифичного активного центра.