Праймер: Начало синтеза ДНК и его роль в репликации.

Введение

Короткая цепь РНК или ДНК, служащая отправной точкой для синтеза ДНК.

Праймер – это короткая одноцепочечная нуклеиновая кислота, используемая всеми живыми организмами для инициирования синтеза ДНК. Синтетический праймер также может называться олиго, сокращение от олигонуклеотида. Ферменты ДНК-полимеразы (ответственные за репликацию ДНК) способны добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей нуклеиновой кислоты, поэтому для начала синтеза комплементарной цепи требуется, чтобы праймер был связан с матрицей. ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды после связывания с РНК-праймером и синтезирует всю цепь. Впоследствии РНК-цепи должны быть точно удалены и заменены ДНК-нуклеотидами, образуя разрыв, известный как ник, который заполняется ферментом, называемым лигазой. Для удаления РНК-праймера требуется несколько ферментов, таких как Fen1, Lig1 и другие, которые работают в координации с ДНК-полимеразой, чтобы обеспечить удаление РНК-нуклеотидов и добавление ДНК-нуклеотидов. Живые организмы используют исключительно РНК-праймеры, в то время как лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, требующие синтеза ДНК in vitro (такие как секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция), обычно используют ДНК-праймеры, поскольку они более термостабильны. Праймеры могут быть разработаны в лаборатории для конкретных реакций, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При разработке ПЦР-праймеров необходимо учитывать специфические параметры, такие как температура плавления праймеров и температура отжига самой реакции. Кроме того, последовательность связывания ДНК праймера in vitro должна быть выбрана специфически, что выполняется с использованием метода, называемого базовым локальным поиском выравнивания (BLAST), который сканирует ДНК и находит конкретные и уникальные области для связывания праймера.

РНК-примеры in vivo

РНК-праймеры используются живыми организмами при инициации синтеза цепи ДНК. Класс ферментов, называемых примазами, добавляет комплементарный РНК-праймер к матричной цепи de novo как на ведущей, так и на отстающей нитях. Начиная со свободного 3'-ОН конца праймера, известного как терминальный конец праймера, ДНК-полимераза может удлинить вновь синтезированную цепь. Ведущая нить в репликации ДНК синтезируется в виде единого непрерывного фрагмента, движущегося вместе с репликативной вилкой, требуя только начального РНК-праймера для начала синтеза. В отстающей нити ДНК-матрица ориентирована в направлении 5'→3'. Поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания в направлении 3'→5', комплементарном матричной цепи, ДНК синтезируется «в обратном» направлении в виде коротких фрагментов, удаляющихся от репликативной вилки, известных как фрагменты Оказаки. В отличие от ведущей нити, этот метод приводит к многократному началу и остановке синтеза ДНК, требуя множественных РНК-праймеров. Вдоль ДНК-матрицы примаза внедряет РНК-праймеры, которые ДНК-полимераза использует для синтеза ДНК в направлении 5'→3'. Ник-трансляция относится к синхронизированной активности полимеразы I при удалении РНК-праймера и добавлении дезоксирибонуклеотидов. Впоследствии между цепями образуется разрыв, называемый ником, который запечатывается ДНК-лигазой. У эукариот удаление РНК-праймеров в отстающей нити необходимо для завершения репликации. Таким образом, по мере синтеза отстающей нити ДНК-полимеразой δ в направлении 5'→3' образуются фрагменты Оказаки – это прерывистые цепи ДНК. Затем, когда ДНК-полимераза достигает 5'-конца РНК-праймера из предыдущего фрагмента Оказаки, она вытесняет 5'-конец праймера, образуя одноцепочечный RNA-клап, который удаляется путем расщепления нуклеазой. Удаление RNA-клапов включает три метода удаления праймера. Первый способ удаления праймера заключается в создании короткого клапа, который непосредственно удаляется эндонуклеазой 1, специфичной к структуре клапа (FEN 1), которая расщепляет 5'-нависающий клап. Этот метод известен как путь удаления РНК-праймера с коротким клапом. Второй способ расщепления РНК-праймера – деградация РНК-цепи с помощью РНКазы, у эукариот известной как РНКаза H2. Этот фермент деградирует большую часть отжаренного РНК-праймера, за исключением нуклеотидов, расположенных вблизи 5'-конца праймера. Таким образом, оставшиеся нуклеотиды образуют клап, который отщепляется с помощью FEN 1. Последний возможный метод удаления РНК-праймера известен как путь длинного клапа. Как и коммерческие программные продукты, такие как ePrime и Beacon Designer. Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР (электронная ПЦР) может быть выполнено для помощи в разработке праймеров, предоставляя температуры плавления и отжига и т.д. По состоянию на 2014 год многие онлайн-инструменты свободно доступны для разработки праймеров, некоторые из которых ориентированы на конкретные области применения ПЦР. Праймеры с высокой специфичностью к подмножеству ДНК-матриц в присутствии множества схожих вариантов могут быть разработаны с использованием некоторых программ (например, DECIPHER) или разработаны независимо для конкретной группы животных. Выбор конкретной области ДНК для связывания праймера требует дополнительных соображений. Следует избегать областей с высоким содержанием моно- и динуклеотидных повторов, поскольку может происходить образование шпилек и способствовать неспецифической гибридизации. Праймеры не должны легко отжигаться друг к другу в смеси, поскольку это явление может привести к образованию продуктов «димера праймеров», загрязняющих конечный раствор. Праймеры также не должны сильно отжигаться к самим себе, поскольку внутренние шпильки и петли могут препятствовать отжигу к ДНК-матрице. При разработке праймеров к задним концам каждого праймера можно добавить дополнительные нуклеотидные основания, что приведет к образованию индивидуальной концевой последовательности на каждом конце амплифицированной области. Одно из применений этой практики – клонирование ТА, специальная техника субклонирования, аналогичная ПЦР, где эффективность может быть увеличена путем добавления AG-хвостов к 5'- и 3'-концам.

RNA primers are used by living organisms in the initiation of synthesizing a strand of DNA. A class of enzymes called primases add a complementary RNA primer to the reading template de novo on both the leading and lagging strands. Starting from the free 3’ OH of the primer, known as the primer terminus, a DNA polymerase can extend a newly synthesized strand. The leading strand in DNA replication is synthesized in one continuous piece moving with the replication fork, requiring only an initial RNA primer to begin synthesis. In the lagging strand, the template DNA runs in the 5′→3′ direction. Since DNA polymerase cannot add bases in the 3′→5′ direction complementary to the template strand, DNA is synthesized ‘backward’ in short fragments moving away from the replication fork, known as Okazaki fragments. Unlike in the leading strand, this method results in the repeated starting and stopping of DNA synthesis, requiring multiple RNA primers. Along the DNA template, primase intersperses RNA primers that DNA polymerase uses to synthesize DNA from in the 5′→3′ direction. Nick translation refers to the synchronized activity of polymerase I in removing the RNA primer and adding deoxyribonucleotides. Later, a gap between the strands is formed called a nick, which is sealed using a DNA ligase. In eukaryotes the removal of RNA primers in the lagging strand is essential for the completion of replication. Thus, as the lagging strand being synthesized by DNA polymerase δ in 5′→3′ direction, Okazaki fragments are formed, which are discontinuous strands of DNA. Then, when the DNA polymerase reaches to the 5’ end of the RNA primer from the previous Okazaki fragment, it displaces the 5′ end of the primer into a single stranded RNA flap which is removed by nuclease cleavage. Cleavage of the RNA flaps involves three methods of primer removal. The first possibility of primer removal is by creating a short flap that is directly removed by flap structure specific endonuclease 1 (FEN 1), which cleaves the 5’ overhanging flap. This method is known as the short flap pathway of RNA primer removal. The second way to cleave a RNA primer is by degrading the RNA strand using a RNase, in eukaryotes it’s known as the RNase H2. This enzyme degrades most of the annealed RNA primer, except the nucleotides close to the 5’ end of the primer. Thus, the remaining nucleotides are displayed into a flap that is cleaved off using FEN 1. The last possible method of removing RNA primer is known as the long flap pathway. as do commercial software products such as ePrime and Beacon Designer. Computer simulations of theoretical PCR results (Electronic PCR) may be performed to assist in primer design by giving melting and annealing temperatures, etc. As of 2014, many online tools are freely available for primer design, some of which focus on specific applications of PCR. Primers with high specificity for a subset of DNA templates in the presence of many similar variants can be designed using by some software (e. g. DECIPHER) or be developed independently for a specific group of animals. Selecting a specific region of DNA for primer binding requires some additional considerations. Regions high in mononucleotide and dinucleotide repeats should be avoided, as loop formation can occur and contribute to mishybridization. Primers should not easily anneal with other primers in the mixture; this phenomenon can lead to the production of 'primer dimer' products contaminating the end solution. Primers should also not anneal strongly to themselves, as internal hairpins and loops could hinder the annealing with the template DNA. When designing primers, additional nucleotide bases can be added to the back ends of each primer, resulting in a customized cap sequence on each end of the amplified region. One application for this practice is for use in TA cloning, a special subcloning technique similar to PCR, where efficiency can be increased by adding AG tails to the 5′ and the 3′ ends.

Дегенерирующие праймеры

В некоторых ситуациях может потребоваться использование дегенерированных праймеров. Это смеси праймеров, которые схожи, но не идентичны. Они могут быть удобны при амплификации одного и того же гена из разных организмов, поскольку последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, потому что сам генетический код является дегенерированным, то есть несколько различных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту. Это позволяет разным организмам иметь значительно отличающиеся генетические последовательности, кодирующие высокосходные белки. По этой причине дегенерированные праймеры также используются, когда дизайн праймера основан на последовательности белка, поскольку конкретная последовательность кодонов неизвестна. Например, последовательность праймера, соответствующая аминокислоте изолейцину, может быть "ATH", где A обозначает аденин, T – тимин, а H – аденин, тимин или цитозин, в соответствии с генетическим кодом каждого кодона, используя символы IUPAC для дегенерированных оснований. Дегенерированные праймеры могут не идеально гибридизироваться с целевой последовательностью, что может значительно снизить специфичность ПЦР-амплификации. Дегенерированные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробиологической экологии. Они позволяют амплифицировать гены из микроорганизмов, которые до сих пор не были культивированы, или восстанавливать гены из организмов, для которых геномная информация недоступна. Обычно дегенерированные праймеры разрабатываются путем выравнивания последовательностей генов, найденных в GenBank. Различия между последовательностями учитываются с помощью дегенераций IUPAC для отдельных оснований. Затем ПЦР-праймеры синтезируются в виде смеси праймеров, соответствующих всем возможным комбинациям кодонной последовательности.