Введение
Класс ферментов
ДНК-топоизомеразы (или топоизомеразы) – это ферменты, которые катализируют изменения в топологическом состоянии ДНК, взаимопревращая расслабленные и сверхзакрученные формы, связанные (катенированные) и несвязанные виды, а также узелковые и неузелковые молекулы ДНК. Топологические проблемы в ДНК возникают из-за переплетенной природы ее двойной спиральной структуры, которая, например, может приводить к перекручиванию дуплекса ДНК во время репликации и транскрипции. Если это перекручивание не устранить, оно в конечном итоге остановит ДНК- или РНК-полимеразы, участвующие в этих процессах, от дальнейшего продвижения по спирали ДНК. Вторая топологическая проблема возникает из-за сцепления или запутывания ДНК во время репликации. Если не разрешить эти сцепления, они будут препятствовать делению клеток. ДНК-топоизомеразы предотвращают и корректируют подобные топологические проблемы. Они делают это, связываясь с ДНК и разрывая фосфодиэфирную цепь одной (топоизомеразы I типа) или обеих (топоизомеразы II типа) нитей ДНК. Этот временный разрыв позволяет распутать или раскрутить ДНК, и в конце этих процессов фосфодиэфирная цепь ДНК вновь запечатывается. Поскольку общий химический состав и структура ДНК не изменяются, субстрат и продукт являются химическими изомерами, различающимися только своей топологией.
Открытие
Первая ДНК-топоизомераза была обнаружена у бактерий Джеймсом С. Вангом в 1971 году и первоначально называлась ω (омега)-белком; сейчас она называется топоизомеразой I (топо I) *Escherichia coli* (E. coli) и является представителем семейства ферментов типа IA. Впоследствии аналогичная активность была обнаружена в эукариотических клетках (печени крысы) Джеймсом Шампу и Ренато Дулбеко; ответственный фермент, эукариотическая топо I, имеет отличный механизм и является представителем семейства типа IB. Первой топоизомеразой II типа, обнаруженной в 1976 году Мартином Геллертом и его коллегами, а также охарактеризованной Николасом Коцарелли и его коллегами, была ДНК-гираза из бактерий. ДНК-гираза катализирует введение отрицательных суперспиралей в ДНК и является единственным ферментом II типа, способным это делать; все остальные катализируют релаксацию ДНК. Ферменты II типа механически отличаются от ферментов I типа тем, что они АТФ-зависимы и временно разрезают обе цепи ДНК, а не только одну. Топоизомеразы типа II впоследствии были идентифицированы в бактериальных вирусах и эукариотах. Коды Topo EC следующие: АТФ-независимые (тип I), EC 5.6.2.1; АТФ-зависимые (тип II): EC 5.6.2.2. Исключением среди топоизомераз типа I является обратная гираза, содержащая домен геликазы (EC 3.6.4.12) и вводящая положительные суперспирали в АТФ-зависимом режиме. Следовательно, это единственная топоизомераза типа I, классифицированная как EC 5.6.2.2 (таблица 1).
Топология ДНК
Двойная спиралеобразная структура ДНК включает в себя переплетение двух полинуклеотидных нитей вокруг друг друга, что потенциально вызывает топологические проблемы. Топология ДНК относится к пересечению двух нитей ДНК, изменяющему изгиб двойной спирали и приводящему к третичным конформациям ДНК, таким как суперспирали, узлы и катенаны. Потенциальные топологические проблемы, связанные с двойной спиралевой структурой ДНК, были признаны вскоре после того, как ее структура была впервые выяснена в 1953 году Джеймсом Уотсоном, Фрэнсисом Криком и Розалинд Франклин и развиты дальнейшей работой Макса Дельбрюка и Джона Кернса. Закрытая круговая двухцепочечная ДНК может быть описана тремя параметрами: число сцепления (Lk), кручение (Tw) и извитость (Wr) (рис. 1). Здесь Lk относится к числу раз, когда две нити связаны, Tw – к числу витков спирали в ДНК, измеряемому относительно спиральной оси, а Wr количественно определяет скручивание пути спирали ДНК в пространстве и часто приравнивается к «суперспирали». Эти параметры связаны следующим образом: Lk = Tw + Wr. Это математическая тождественность, первоначально полученная Калугареану в 1959 году и известная как теорема Калугареану, или теорема Калугареану–Уайта–Фуллера. Lk нельзя изменить без разрыва одной или обеих нитей спирали; Tw и Wr взаимопревращаемы и зависят от условий раствора. Суперспираль – общеупотребительный термин для ДНК с ненулевой разницей в числе сцеплений, более корректно называемой удельной разницей в числе сцеплений (σ = ΔLk/Lk0, где Lk0 – среднее число сцеплений расслабленной круговой ДНК). ДНК считается положительно суперспирализованной, если ее Lk выше, чем Lk0 для расслабленного состояния (Lk > Lk0 = ΔLk, ΔLk > 0); это означает, что Tw и/или Wr увеличены относительно расслабленной молекулы. И наоборот, ДНК отрицательно суперспирализована, если Lk молекулы ниже, чем Lk0 (ΔLk < 0). Последствия топологических возмущений в ДНК иллюстрируются репликацией ДНК, во время которой нити дуплекса разделяются; это разделение приводит к образованию положительных суперспиралей (перекручиванию ДНК) впереди репликативной вилки и переплетению дочерних нитей (прекатенанов) позади (рис. 2). Если положительные суперспирали не расслабляются, продвижение репликативной вилки замедляется, а неспособность разъединить дочерние нити препятствует сегрегации генома, необходимой для деления клеток. Транскрипция РНК-полимеразой также генерирует положительные суперспирали впереди и отрицательные суперспирали позади транскрипционного комплекса (рис. 2). Этот эффект известен как модель двойного суперспирализованного домена, описанная Лероем Лю и Джеймсом Вангом в 1987 году. Эти топологические возмущения должны быть разрешены для продолжения метаболизма ДНК, позволяя клетке эффективно реплицировать, транскрибировать и разделять геном, обеспечивая деление клеток и жизнеспособность. Узлы в ДНК можно обнаружить в бактериофагах и как продукты реакций рекомбинации. Кроме того, компактизация генома *E. coli* частично достигается за счет отрицательной суперспирализации. [[Файл:Topological ramifications of DNA replication and transcription. jpg|thumb|286x286px|Рисунок 2. Топологические последствия метаболизма ДНК. i) Во время репликации ДНК разделение нитей приводит к образованию положительных суперспиралей впереди продвигающегося белкового комплекса и образованию прекатенанов позади. Прекатенаны образуются, когда вновь синтезированные дуплексы оборачиваются друг вокруг друга, и, если они не удалены до завершения репликации, образуются катенаны. ii) Во время транскрипции разделение нитей приводит к образованию положительных суперспиралей впереди продвигающегося белкового комплекса и образованию отрицательных суперспиралей позади.]
Тип IA
Тип IA мономерный и связывается с одноцепочечными участками ДНК. Они вносят временный одноцепочечный разрыв посредством образования тирозилфосфатной связи между тирозином в ферменте и 5'-фосфатом в ДНК. Участок ДНК, в пределах которого происходит разрыв, называется «воротами» или G-сегментом, и его расщепление позволяет другому участку ДНК, «транспортному» или T-сегменту, пройти через него в процессе «перехода цепи». За этим следует лигация G-сегмента. Для перехода цепи топоизомераза IA должна претерпеть конформационное изменение, чтобы открыть ворота ДНК и обеспечить передачу T-сегмента. Во время реакции релаксации ДНК этот процесс изменяет топологический линк ДНК на +/- 1 (рис. 4). Примеры топоизомераз типа IA включают прокариотические топо I и III, эукариотические топо IIIα и IIIβ и археальный фермент обратную гиразу. Обратная гираза, встречающаяся в термофильных археях, состоит из топоизомеразы типа IA, связанной с геликазой, и является единственным известным ферментом, способным вводить положительные суперспирали в ДНК. |left|thumb|Рисунок 4. Механизм перехода цепи для топоизомераз типа IA. (1) Топоизомераза связывается с областью G-сегмента одноцепочечной ДНК, (2) G-сегмент расщепляется. (3) Ворота ДНК открываются, (4) что позволяет T-сегменту пройти через расщепленную G-цепочку. (5) Ворота ДНК закрываются, (6) и G-цепочка религаруется, изменяя топологический линк на 1. (7) Затем топоизомераза может пройти еще один раунд релаксации или диссоциировать от ДНК. Топоизомераза типа IA (домены 1-4) изображена розовым цветом, активный сайт тирозина – желтым, а ДНК – серым.|236x236px
Тип IB
Топоизомеразы типа IB катализируют реакции, включающие временные одноцепочечные разрывы в ДНК посредством образования тирозилфосфатной связи между тирозином в ферменте и 3'-фосфатом в ДНК. В отличие от механизма прохождения нити, эти ферменты функционируют посредством «поворота» или «контролируемого вращения» разрезанной цепи вокруг неповрежденной цепи. Этот механизм контролируемого вращения был впервые описан для Vaccinia topo I и позволяет вращать свободный конец ДНК вокруг неповрежденной цепи, при этом скорость контролируется «трением» внутри ферментной полости до повторного лигирования разрыва (рис. 3). Это приводит к переменному изменению числа сцеплений при каждом разрезе и лигировании. Этот механизм отличается от механизма ферментов типа IA, и эти две группы ферментов структурно и эволюционно не связаны. Примеры топоизомераз типа IB включают эукариотические ядерные и митохондриальные topo I, а также вирусные topo I, хотя они были обнаружены во всех трех доменах жизни.
Тип IC
Топоизомеразы типа IC разделяют схожий механизм с ферментами типа IB, но структурно отличаются. Единственным представителем является топо V, обнаруженный у гипертермофила Methanopyrus kandleri.
Тип II
Топоизомеразы II типа катализируют изменения в топологии ДНК посредством преходящих двунитевых разрывов в ДНК. Реакции происходят на двунитевых ДНК-субстратах и протекают посредством механизма прохождения нити (рис. 5). Диапазон реакций включает релаксацию ДНК, суперспирализацию ДНК, распутывание узлов и декатенацию. В то время как все топоизомеразы II типа могут катализировать релаксацию ДНК, гираза, типичная бактериальная топоизомераза, также способна вводить отрицательные суперспирали. В отличие от топоизомераз I типа, которые обычно являются мономерами, топоизомеразы II типа представляют собой гомодимеры или гетеротетрамеры. Они классифицируются на два подтипа на основе эволюционных, структурных и механистических соображений. Общий механизм прохождения нитей для топоизомераз типа II начинается со связывания одного дуплекса ДНК, называемого сегментом ворот (G-сегмент), в ДНК-воротах. Другой дуплекс, называемый транспортным сегментом (T-сегмент), захватывается АТФ-зависимым зажимом и проходит через временный разрыв в G-сегменте, включающий 5'-фосфотирозиновые связи в обеих нитях, прежде чем высвобождается через C-ворота, а G-сегмент религаруется (рис. 5). Оборот фермента требует связывания и гидролиза АТФ. Рисунок 5. Механизм прохождения нитей топоизомеразы типа II (размер 325x325 пикселей). (1) G-сегмент связывается с ДНК-воротами, а T-сегмент захватывается. (2) Связывание АТФ стимулирует димеризацию N-ворот, G-сегмент расщепляется, а T-сегмент проходит через разрыв. (3) G-сегмент религаруется, а T-сегмент выходит через C-ворота. Для топоизомераз типа IIB C-ворот нет, поэтому как только T-сегмент проходит через G-сегмент, он высвобождается из фермента. (4) Диссоциация АДФ и Pi позволяет открыть N-ворота, в результате чего фермент либо остается связанным с G-сегментом, готовым захватить следующий T-сегмент, либо (5) диссоциирует от G-сегмента.
Тип IIА
Топоизомеразы типа IIA катализируют временные разрывы двойных цепей ДНК посредством образования тирозилфосфатных связей между тирозинами в ферменте (по одному на каждой субъединице) и 5'-фосфатами, сдвинутыми на 4 основания в противоположных цепях ДНК. Реакция прохождения цепи может быть внутри- или межмолекулярной (рис. 5), что позволяет изменять степень суперспирализации и образование узлов, или разделять переплетенные молекулы, соответственно. Этот процесс изменяет линкольное число ДНК на ±2. Примеры топоизомераз типа IIA включают эукариотические топо IIα и топо IIβ, а также бактериальную гиразу и топо IV. Гираза ДНК следует тому же механизму прохождения двойных цепей, что и другие ферменты II типа, но обладает уникальными особенностями, связанными с ее способностью вводить отрицательные суперспирали в ДНК. Сегмент G является частью гораздо более длинного участка ДНК (>100 п.н.), который обвивается вокруг фермента, одна из ветвей которого формирует сегмент T, который проходит через разрыв двойной цепи (рис. 5). В случае гиразы, значительная часть свободной энергии, высвобождающейся при гидролизе АТФ, преобразуется в торсионное напряжение в ДНК, то есть суперспирализация – энергозависимый процесс. Более того, в отсутствие АТФ гираза способна удалять отрицательные суперспирали в более медленной реакции релаксации ДНК.
Тип IIB
Тип IIB также катализирует преходящие разрывы двойной спирали ДНК посредством образования тирозилфосфатных связей между тирозинами в составе фермента и 5'-фосфатами в комплементарных цепях ДНК, однако в случае ферментов IIB разрывы двойной спирали характеризуются сдвигом в 2 нуклеотида. Ферменты типа IIB демонстрируют значительные структурные различия, но эволюционно связаны с ферментами типа IIA. Эти различия включают отсутствие одного из белковых "затворов" (С-затвор) (рис. 5). Изначально обнаруженные у архей, они также встречаются у эукариот, особенно у растений; к ним относятся топоизомеразы VI и VIII. Топоизомераза VI – наиболее изученный фермент этого подтипа и считается предпочтительным декатеназом.
Как цели наркотиков
Для неспециалистов, пожалуй, наиболее важным аспектом топоизомераз является их роль как мишеней для лекарственных препаратов в антибактериальной и противораковой химиотерапии; несколько антибактериальных и противораковых препаратов, воздействующих на топоизомеразы, включены в Типовой список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения 2019 года. Это объясняется тем, что их реакции протекают через временные разрывы в ДНК, которые, если стабилизированы связыванием с лекарством, могут привести к гибели клеток из-за образования токсичных одно- или двухцепочечных разрывов в геномной ДНК. Большинство препаратов, нацеленных на топоизомеразы, действуют именно таким образом, то есть стабилизируют ковалентный комплекс «фермент-ДНК».
Антибактериальные соединения
Хотя топоизомеразы I типа, такие как бактериальная топоизомераза I, являются перспективными мишенями для антибиотиков, в настоящее время не существует препаратов, находящихся в клиническом применении, которые воздействовали бы на эти ферменты. Однако ферменты типа II, ДНК-гираза и ДНК-топоизомераза IV, стали очень успешными мишенями для широко используемых фторхинолоновых антибиотиков (рис. 6).
Фторхинолоны (FQ)
Антибактериальные соединения класса хинолонов были впервые разработаны в 1960-х годах и начали применяться в клинической практике с 1980-х годов. Производные фторхинолонов, такие как ципрофлоксацин, левофлоксацин и моксифлоксацин (рис. 6), оказались весьма эффективными. Эти соединения действуют, взаимодействуя со своей мишенью (гиразой или топоизомеразой IV) и ДНК в месте расщепления, стабилизируя ковалентный комплекс расщепления ДНК-белка. В частности, они интеркалируют в ДНК и предотвращают стадию религации ДНК в реакции топоизомеразы (рис. 5). Это высокоэффективный механизм ингибирования, который также используется рядом противоопухолевых препаратов, нацеленных на топоизомеразы. Несмотря на их значительный успех, устойчивость к фторхинолонам является серьезной проблемой. Ведутся разработки аналогичных соединений, и есть надежда, что некоторые из них в будущем смогут заменить фторхинолоны.
Аминокумарины
Аминокумарины (рис. 6), такие как новобиоцин, хлорбиоцин и кумермицин А1, – это природные продукты, выделенные из Streptomyces, которые ингибируют АТФазную реакцию гиразы и топоизомеразы IV, стабилизируя комплекс расщепления аналогично фторхинолонам (FQ). Хотя сами эти белки не пригодны для использования в качестве антибактериальных препаратов, их механизм действия может послужить основой для разработки новых антибактериальных соединений. Другие белковые ингибиторы гиразы предотвращают связывание ДНК топоизомеразой, вместо того чтобы стабилизировать комплексы расщепления. К ним относятся YacG и белки с повторами пентапептидов, такие как QnrB1 и MfpA; эти белковые ингибиторы также обуславливают устойчивость к фторхинолонам. Рисунок 6. Структуры антибиотических соединений, воздействующих на бактериальную ДНК-гиразу и топоизомеразу IV.
Противоопухолевые соединения
Как топоизомераза I, так и топоизомераза II человека (и α, и β изоформы) могут служить мишенями в противораковой химиотерапии (рис. 7). Большинство этих соединений действуют схожим образом с фторхинолонами, то есть стабилизируя ковалентный комплекс расщепления ДНК-белка; благодаря этому они получили название "топоизомеразных ядов", в отличие от каталитических ингибиторов. Несколько ингибиторов топоизомеразы человека включены в Список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения.
Камптотецин (CPT)
Камптотецин (рис. 7), изначально выделенный из дерева Camptotheca acuminata, воздействует на топоизомеразу I человека, а его производные, такие как топотекан и иринотекан, широко применяются в химиотерапии рака.
Роль топоизомеразы в регуляции транскрипции
По крайней мере одна топоизомераза, ДНК-топоизомераза II бета (топо IIβ), выполняет регуляторную функцию в транскрипции генов. Двойные разрывы ДНК, зависимые от Topo IIβ, и компоненты системы репарации ДНК важны для быстрой экспрессии генов раннего ответа, а также для регуляции генов в ответ на сигналы. Topo IIβ, совместно с другими ассоциированными ферментами,