Ген-репортер в молекулярной биологии

Введение

Техника в молекулярной биологии

В молекулярной биологии репортерный ген (часто просто репортер) — это ген, который исследователи присоединяют к регуляторной последовательности другого гена, представляющего интерес, у бактерий, в клеточных культурах, у животных или растений. Такие гены называются репортерными, поскольку характеристики, которые они обеспечивают организмам, экспрессирующим их, легко идентифицируются и измеряются, либо потому, что они служат селективными маркерами. Репортерные гены часто используются для определения того, был ли определенный ген поглощен или экспрессирован в популяции клеток или организмов.

Анализы трансформации и трансфекции

Многие методы трансфекции и трансформации – два способа экспрессии чужеродного или модифицированного гена в организме – эффективны лишь у небольшого процента клеток, подвергнутых этим процедурам. Таким образом, необходим метод для выявления небольшого числа успешных событий внедрения гена. Репортерные гены, используемые таким образом, обычно экспрессируются под контролем собственного промотора (участков ДНК, инициирующих транскрипцию генов), независимо от промотора вводимого гена, представляющего интерес; репортерный ген может экспрессироваться конститутивно (то есть постоянно) или индуктивно, посредством внешнего воздействия, например, добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в систему β-галактозидазы. Для активации репортерных генов их можно экспрессировать конститутивно, непосредственно присоединив к гену, представляющему интерес, для создания генного слияния. Этот метод является примером использования цис-действующих элементов, при котором оба гена находятся под контролем одних и тех же промоторных элементов и транскрибируются в единую молекулу мРНК. Затем мРНК транслируется в белок. Важно, чтобы оба белка могли правильно сворачиваться в активные конформации и взаимодействовать со своими субстратами, несмотря на слияние. При создании ДНК-конструкции обычно включают сегмент ДНК, кодирующий гибкий полипептидный линкер, чтобы репортерный белок и целевой белок минимально влияли друг на друга. Репортерные гены также могут экспрессироваться индукцией в процессе роста. В этих случаях для экспрессии репортерного гена используются транс-действующие элементы, такие как факторы транскрипции. Анализ с использованием репортерных генов все чаще применяется в высокопроизводительном скрининге (HTS) для выявления малых молекул – ингибиторов и активаторов – белковых мишеней и сигнальных путей в целях разработки лекарств и химической биологии. Поскольку сами репортерные ферменты (например, люцифераза светлячков) могут быть прямыми мишенями для малых молекул и искажать интерпретацию данных HTS, были разработаны новые конструкции репортеров, основанные на принципе совпадения и включающие подавление артефактов.

Many methods of transfection and transformation – two ways of expressing a foreign or modified gene in an organism – are effective in only a small percentage of a population subjected to the techniques. Thus, a method for identifying those few successful gene uptake events is necessary. Reporter genes used in this way are normally expressed under their own promoter (DNA regions that initiates gene transcription) independent from that of the introduced gene of interest; the reporter gene can be expressed constitutively (that is, it is "always on") or inducibly with an external intervention such as the introduction of Isopropyl β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) in the β galactosidase system. To activate reporter genes, they can be expressed constitutively, where they are directly attached to the gene of interest to create a gene fusion. This method is an example of using cis acting elements where the two genes are under the same promoter elements and are transcribed into a single messenger RNA molecule. The mRNA is then translated into protein. It is important that both proteins be able to properly fold into their active conformations and interact with their substrates despite being fused. In building the DNA construct, a segment of DNA coding for a flexible polypeptide linker region is usually included so that the reporter and the gene product will only minimally interfere with one another. Reporter genes can also be expressed by induction during growth. In these cases, trans acting elements, such as transcription factors are used to express the reporter gene. Reporter gene assay have been increasingly used in high throughput screening (HTS) to identify small molecule inhibitors and activators of protein targets and pathways for drug discovery and chemical biology. Because the reporter enzymes themselves (e. g. firefly luciferase) can be direct targets of small molecules and confound the interpretation of HTS data, novel coincidence reporter designs incorporating artifact suppression have been developed.

Промоторные анализы

Репортерные гены могут использоваться для оценки активности конкретного промотора в клетке или организме. В этом случае отсутствует отдельный "ген, представляющий интерес"; репортерный ген просто помещают под контроль целевого промотора и количественно измеряют активность продукта репортерного гена. Результаты обычно представляются относительно активности под "консенсусным" промотором, известным своей способностью индуцировать сильную экспрессию генов.

Другие виды использования

Более сложное применение репортерных генов в крупном масштабе – двухгибридный скрининг, предназначенный для идентификации белков, которые взаимодействуют друг с другом естественным образом in vivo.