Амилоиды: структура, функции и роль в заболеваниях.

Введение

Нерастворимый белковый агрегат с фибриллярной морфологией.

Амилоиды – это агрегаты белков, характеризующиеся фибриллярной морфологией, обычно диаметром 7–13 нм, β-структурой вторичной структуры (известной как кросс-β) и способностью окрашиваться специфическими красителями, такими как конго красный. В организме человека амилоиды связаны с развитием различных заболеваний, известных как амилоидоз, и могут играть роль в некоторых нейродегенеративных заболеваниях. Некоторые из этих заболеваний преимущественно спорадические, лишь немногие случаи – семейные, другие – исключительно семейные. Некоторые возникают в результате медицинского лечения. Прионы – это инфекционная форма амилоидов, способная служить матрицей для преобразования других неинфекционных форм. Амилоиды также могут выполнять нормальные биологические функции, например, в образовании фимбрий у некоторых родов бактерий, передаче эпигенетических признаков у грибов, а также в отложении пигмента и высвобождении гормонов у человека. Эти полипептидные цепи обычно формируют β-структуры, которые агрегируют в длинные волокна, однако идентичные полипептиды могут сворачиваться в несколько различных амилоидных конформаций. Необычная вторичная структура, названная α-листом, была предложена в качестве токсичного компонента белков-предшественников амилоида, но в настоящее время эта идея не получила широкого признания.

Определение

Название «амилоид» происходит от ранной ошибочной идентификации Рудольфом Вирховым этого вещества как крахмала (amylum на латыни, от греч. ἄμυλον), основанной на примитивных методах окрашивания йодом. В течение некоторого времени научное сообщество спорило о том, являются ли амилоидные отложения жировыми или углеводными, пока в 1859 году не было установлено, что они представляют собой отложения альбумоидного белкового вещества. Классическое гистопатологическое определение амилоида – это внеклеточное, белковое фибриллярное отложение, демонстрирующее вторичную структуру β-листа и идентифицируемое двулучепреломлением яблочно-зеленого цвета при окрашивании конго красным под поляризованным светом. Эти отложения часто вовлекают различные сахара и другие компоненты, такие как компонент сывороточного амилоида P, что приводит к образованию сложных и иногда неоднородных структур. В последнее время это определение подвергается критике, поскольку некоторые классические амилоидные образования были обнаружены в отчетливо внутриклеточных локализациях. Более современное, биофизическое определение является более широким и включает любой полипептид, который полимеризуется с образованием кросс-β структуры in vivo или in vitro, внутри или вне клеток. Микробиологи, биохимики, биофизики, химики и физики в основном приняли это определение, что вызвало некоторые разногласия в биологическом сообществе относительно терминологии.

Структура

Амилоиды образуются из длинных неразветвленных волокон, характеризующихся протяженной вторичной структурой β-листа, в которой отдельные β-цепи (цветные стрелки на соседнем рисунке) расположены перпендикулярно длинной оси волокна. Такая структура известна как структура «кросс-β». Каждое отдельное волокно может иметь ширину 7–13 нанометров и длину в несколько микрометров. Характерными являются два сигнала дифракционного рассеяния, возникающие при 4,7 и 10 Å (0,47 нм и 1,0 нм), соответствующие расстояниям между цепями и расстояниям укладки в β-листах. Исследования рентгеновской дифракции микрокристаллов выявили атомистические детали центральной области амилоида, хотя и только для упрощенных пептидов, длина которых значительно меньше, чем у пептидов или белков, участвующих в развитии заболеваний. Кристаллографические структуры показывают, что короткие участки из амилоидогенных областей белков, склонных к образованию амилоидов, ориентированы перпендикулярно оси филамента, что соответствует «кросс-β» характеристике амилоидной структуры. Они также демонстрируют ряд особенностей амилоидных структур: соседние β-листы плотно упакованы друг с другом через интерфейс, лишенный воды (поэтому он называется «сухим интерфейсом»), при этом противоположные β-цепи слегка смещены относительно друг друга, так что их боковые цепи перекрываются. Этот компактный, обезвоженный интерфейс был назван «стерической молнией». Существует немного разработанных представлений о том, как сложные топологии полипептидной цепи дисульфид-связанных белков, склонных к образованию амилоидных фибрилл (например, инсулина и лизоцима), приобретают амилоидный β-листный мотив. Наличие множественных ограничений значительно уменьшает доступное конформационное пространство, что делает вычислительное моделирование амилоидных структур более осуществимым. Одним из осложняющих факторов в изучении амилоидогенных полипептидов является то, что идентичные полипептиды могут сворачиваться в несколько различных амилоидных конформаций. Это имеет важное биологическое значение, поскольку считается, что это объясняет феномен прионных штаммов.

Amyloids are formed of long unbranched fibers that are characterized by an extended β sheet secondary structure in which individual β strands (β strands) (coloured arrows in the adjacent figure) are arranged in an orientation perpendicular to the long axis of the fiber. Such a structure is known as cross β structure. Each individual fiber may be 7–13 nanometres in width and a few micrometres in length. There are two characteristic scattering diffraction signals produced at 4.7 and 10 Å (0.47 nm and 1.0 nm), corresponding to the interstrand and stacking distances in β sheets. X ray diffraction studies of microcrystals revealed atomistic details of core region of amyloid, although only for simplified peptides having a length remarkably shorter than that of peptides or proteins involved in disease. The crystallographic structures show that short stretches from amyloid prone regions of amyloidogenic proteins run perpendicular to the filament axis, consistent with the "cross β" feature of amyloid structure. They also reveal a number of characteristics of amyloid structures – neighboring β sheets are tightly packed together via an interface devoid of water (therefore referred to as dry interface), with the opposing β strands slightly offset from each other such that their side chains interdigitate. This compact dehydrated interface created was termed a steric zipper interface. There are few developed ideas on how the complex backbone topologies of disulfide constrained proteins, which are prone to form amyloid fibrils (such as insulin and lysozyme), adopt the amyloid β sheet motif. The presence of multiple constraints significantly reduces the accessible conformational space, making computational simulations of amyloid structures more feasible. One complicating factor in studies of amyloidogenic polypeptides is that identical polypeptides can fold into multiple distinct amyloid conformations. It has notable biological consequences given that it is thought to explain the prion strain phenomenon.

Формирование

Амилоид образуется в результате полимеризации сотен или тысяч мономерных пептидов или белков в длинные волокна. Формирование амилоида включает фазу задержки (также называемую фазой нуклеации), экспоненциальную фазу (также называемую фазой роста) и фазу плато (также называемую фазой насыщения), как показано на рисунке. Действительно, при построении графика количества фибрилл в зависимости от времени наблюдается сигмоидальная зависимость, отражающая три отчетливые фазы. В простейшей модели «нуклеированной полимеризации» (обозначенной красными стрелками на рисунке ниже) отдельные развернутые или частично развернутые полипептидные цепи (мономеры) превращаются в ядро (мономер или олигомер) посредством термодинамически неблагоприятного процесса, происходящего в начале фазы задержки. Лишь позже эти агрегаты структурно реорганизуются в ядра, к которым присоединяются и реорганизуются другие дезорганизованные олигомеры посредством шаблонного или индуцированного соответствия (эта модель «ядерного конформационного преобразования»), в конечном итоге формируя фибриллы. Однако в некоторых случаях свернутые белки могут агрегировать, не преодолевая основной энергетический барьер для разворачивания, заселяя конформации, подобные нативным, в результате тепловых флуктуаций, высвобождения лигандов или локального разворачивания, происходящего в определенных обстоятельствах. Константы скорости различных стадий могут быть определены путем глобальной аппроксимации ряда временных зависимостей агрегации (например, эмиссии флуоресценции ThT в зависимости от времени), зарегистрированных при различных концентрациях белка. Например, люди производят амилин, амилоидогенный пептид, связанный с диабетом II типа, но у крыс и мышей пролины замещены в критических положениях, и амилоидогенез не происходит. Исследования, сравнивающие синтетический и рекомбинантный β-амилоидный пептид в анализах, измеряющих скорость фибрилляции, однородность фибрилл и клеточную токсичность, показали, что рекомбинантный β-амилоидный пептид имеет более высокую скорость фибрилляции и большую токсичность, чем синтетический β-амилоидный пептид. Существуют различные классы полипептидных последовательностей, формирующих амилоид. Другие полипептиды и белки, такие как амилин и β-амилоидный пептид, не имеют простой консенсусной последовательности и, как считается, агрегируют через сегменты последовательности, обогащенные гидрофобными остатками или остатками с высокой склонностью к образованию β-листковой структуры. Перекрестная полимеризация (фибриллы одной полипептидной последовательности, вызывающие образование фибрилл другой последовательности) наблюдается in vitro и, возможно, in vivo. Это явление важно, поскольку оно может объяснить межвидовое распространение прионов и различные скорости распространения прионов, а также статистическую связь между болезнью Альцгеймера и диабетом 2 типа. В целом, чем более сходны пептидные последовательности, тем эффективнее происходит перекрестная полимеризация, хотя совершенно различные последовательности могут перекрестно полимеризоваться, а очень похожие последовательности могут даже быть «блокаторами», предотвращающими полимеризацию.

Amyloid is formed through the polymerization of hundreds to thousands of monomeric peptides or proteins into long fibers. Amyloid formation involves a lag phase (also called nucleation phase), an exponential phase (also called growth phase) and a plateau phase (also called saturation phase), as shown in the figure. Indeed, when the quantity of fibrils is plotted versus time, a sigmoidal time course is observed reflecting the three distinct phases. In the simplest model of 'nucleated polymerization' (marked by red arrows in the figure below), individual unfolded or partially unfolded polypeptide chains (monomers) convert into a nucleus (monomer or oligomer) via a thermodynamically unfavourable process that occurs early in the lag phase. Only later on, will these aggregates reorganise structurally into nuclei, on which other disorganised oligomers will add and reorganise through a templating or induced fit mechanism (this 'nucleated conformational conversion' model), eventually forming fibrils. In some cases, however, folded proteins can aggregate without crossing the major energy barrier for unfolding, by populating native like conformations as a consequence of thermal fluctuations, ligand release or local unfolding occurring in particular circumstances. The rate constants of the various steps can be determined from a global fit of a number of time courses of aggregation (for example ThT fluorescence emission versus time) recorded at different protein concentrations. For example, humans produce amylin, an amyloidogenic peptide associated with type II diabetes, but in rats and mice prolines are substituted in critical locations and amyloidogenesis does not occur. Studies comparing synthetic to recombinant β amyloid peptide in assays measuring rate of fibrillation, fibril homogeneity, and cellular toxicity showed that recombinant β amyloid peptide has a faster fibrillation rate and greater toxicity than synthetic β amyloid peptide. There are multiple classes of amyloid forming polypeptide sequences. Other polypeptides and proteins such as amylin and the β amyloid peptide do not have a simple consensus sequence and are thought to aggregate through the sequence segments enriched with hydrophobic residues, or residues with high propensity to form β sheet structure. Cross polymerization (fibrils of one polypeptide sequence causing other fibrils of another sequence to form) is observed in vitro and possibly in vivo. This phenomenon is important, since it would explain interspecies prion propagation and differential rates of prion propagation, as well as a statistical link between Alzheimer's and type 2 diabetes. In general, the more similar the peptide sequence the more efficient cross polymerization is, though entirely dissimilar sequences can cross polymerize and highly similar sequences can even be "blockers" that prevent polymerization.

Токсичность для амилоидов

Причины, по которым амилоид вызывает заболевания, остаются неясными. В некоторых случаях отложения физически нарушают архитектуру тканей, что указывает на нарушение функции за счет объемного эффекта. Растет понимание того, что гибель клеток, особенно при нейродегенеративных заболеваниях, вызывают не зрелые амилоидные фибриллы, а префибриллярные интермедиаты. Однако фибриллы далеки от безвредности, поскольку они поддерживают активность сети поддержания белкового гомеостаза, высвобождают олигомеры, индуцируют образование токсичных олигомеров посредством вторичной нуклеации, неограниченно растут и распространяются из области в область.

Нарушение регуляции кальция наблюдается на ранних стадиях в клетках, подвергшихся воздействию белковых олигомеров. Эти небольшие агрегаты способны формировать ионные каналы в липидных бислоях мембран и активировать NMDA- и AMPA-рецепторы. Предполагается, что формирование каналов объясняет нарушение регуляции кальция и дисфункцию митохондрий, обеспечивая неселективную утечку ионов через клеточные мембраны. Исследования показали, что отложение амилоида связано с дисфункцией митохондрий и, как следствие, с образованием реактивных видов кислорода (ROS), которые могут инициировать сигнальный путь, ведущий к апоптозу. Имеются данные, свидетельствующие о том, что амилоидные полимеры (например, полимер хентингтина, связанный с болезнью Гентингтона) могут индуцировать полимеризацию основных амилоидогенных белков, что должно быть вредным для клеток. Кроме того, белки-партнеры этих важных белков также могут быть секвестрированы. Вероятно, все эти механизмы токсичности играют определенную роль. Фактически, агрегация белка приводит к образованию множества агрегатов, каждый из которых, вероятно, в той или иной степени токсичен. После воздействия клеток и животных на эти виды, независимо от их природы, было выявлено широкое разнообразие биохимических, физиологических и цитологических нарушений. Олигомеры также взаимодействуют с различными молекулярными мишенями. Следовательно, маловероятно существование уникального механизма токсичности или уникального каскада клеточных событий. Неправильная конформация белковых агрегатов вызывает множество аберрантных взаимодействий с множеством клеточных компонентов, включая мембраны, белковые рецепторы, растворимые белки, РНК, мелкие метаболиты и т.д.

Гистологическое окрашивание

В клинической практике амилоидные заболевания обычно выявляют по изменению спектроскопических свойств плоских ароматических красителей, таких как тиофлавин Т, красный конго или NIAD 4. Как правило, это объясняется изменением микроокружения, поскольку эти красители внедряются между β-листами, ограничивая их структуру. Положительная реакция на красный конго остается золотым стандартом диагностики амилоидоза. В общем случае, связывание красного конго с амилоидными бляшками при наблюдении в поляризованном свете вызывает типичное яблочно-зеленое двулучепреломление. В последнее время значительное увеличение квантового выхода флуоресценции NIAD 4 было использовано для получения флуоресцентных изображений с суперразрешением амилоидных фибрилл и олигомеров. Для предотвращения неспецифического окрашивания другие гистологические красители, такие как гематоксилин и эозин, используются для подавления активности красителей в других областях, например, в ядре, где краситель может связываться. Современные технологии получения антител и иммуногистохимия упростили специфическое окрашивание, но это часто может вызывать трудности, поскольку эпитопы могут быть скрыты в амилоидной складке; в целом, структура амилоидного белка отличается от конформации, которую распознают антитела.