Ағынды цитометрия: жасушалар мен бөлшектерді талдау әдісі

Ағын цитометриясы – жасушалар мен бөлшекшелердің физикалық-химиялық қасиеттерін анықтайтын биологиялық және химиялық техника. Шапшаң анализ, дәл деректер!

15 мин оқу

100%

Дереккөз: Flow cytometry — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Биология және химиядағы зертханалық әдіс. Ағымдық цитометрия (АК) – жасушалар немесе бөлшектер популяциясының физикалық және химиялық қасиеттерін анықтау және өлшеуге қолданылатын техника. Бұл процесте жасушалар немесе бөлшектер бар үлгі сұйықтыққа таратылып, ағымдық цитометр құралына жіберіледі. Үлгі лазер сәулесі арқылы бір мезгілде бір жасушадан өтетіндей етіп шоғырландырылады, онда шашыраған жарық жасушалар мен олардың құраушыларына тән болады. Жасушалар көбінесе флуоресценттік маркерлермен белгіленеді, сондықтан жарық сіңіріліп, содан кейін толқын ұзындығының белгілі бір диапазонында шығарылады. Он мыңдаған жасуша тез арада қарастырылып, жиналған деректер компьютермен өңделеді. Ағымдық цитометрия негізгі зерттеулерде, клиникалық тәжірибеде және клиникалық сынақтарда кеңінен қолданылады. Ағымдық цитометрияның қолданылу салалары:
Жасушаларды санау
Жасушаларды сұрыптау
Жасушалардың қасиеттері мен функцияларын анықтау
Микроорганизмдерді анықтау
Биомаркерлерді анықтау
Белок инженериясын анықтау
Қан қатерлі аурулары сияқты денсаулық бұзылыстарын диагностикалау
Геном мөлшерін өлшеу

Ағымдық цитометрия анализаторы – үлгіден сандық деректер беретін құрал. Ағымдық цитометрияны қолданатын басқа құралдарға жасушаларды сұрыптау құралдары жатады, олар жасушаларды олардың оптикалық қасиеттеріне сәйкес физикалық түрде бөліп, тазартады.

Технологияның атауы

Флуоресценцияға негізделген ағын цитометриясы технологиясының түпнұсқалық атауы "импульстік цитофотометрия" (немісше: Impulszytophotometrie) болды, бұл флуоресценцияға негізделген ағын цитометриясы бойынша алғашқы патенттік өтінімге сүйенген. 1976 жылы Флорида штатындағы Пенсакола қаласында өткен Автоматтандырылған цитология жөніндегі 5-ші Америка инженерлік қорының конференциясында – алғашқы флуоресценциялық ағын цитометрі 1968 жылы енгізілгеннен кейін сегіз жыл өткен соң – "ағын цитометриясы" деген атауды қолдануға бірлесіп келісілді, және бұл термин тез арада кеңінен танымал болды.

Ағын цитометрлері

Қазіргі заманғы ағын цитометрлері секундына мыңдаған бөлшектерді «нақты уақытта» талдауға қабілетті және егер жасушаларды сұрыптаушы ретінде конфигурацияланса, ұқсас жылдамдықпен белгілі оптикалық қасиеттері бар бөлшектерді белсенді түрде бөліп, оқшаулай алады. Ағын цитометрі микроскопқа ұқсас, бірақ клетканың кескінін шығарудың орнына, ағын цитометриясы жоғары өнімділікті, клетка бойынша клетка бойынша белгіленген оптикалық параметрлерді автоматты түрде өлшеуді ұсынады. Қатты тіндерді талдау үшін алдымен бір жасушалы суспензия дайындалуы керек. Ағын цитометрі бес негізгі құрамдас бөлікке ие: ағынды ұяшық, өлшеу жүйесі, детектор, күшейткіш жүйесі және сигналдарды талдау үшін компьютер. Ағымы бар ұяшықта сұйықтық ағыны (қаптама сұйықтығы) бар, ол ұяшықтарды алып жүреді және оларды бір қатарда өткізеді. Өлшеу жүйесі жиі импедансты (немесе өткізгіштікті) өлшеуді және оптикалық жүйелерді – шамдарды (терез, ксенон); жоғары қуатты сумен салқындатылған лазерлерді (аргон, криптон, бояу лазері); төмен қуатты ауамен салқындатылған лазерлерді (аргон (488 нм), қызыл HeNe (633 нм), жасыл HeNe, HeCd (UV)); жарық сигналдарын шығаратын диодты лазерлер (көк, жасыл, қызыл, қызғылт түсті) пайдаланады. Детектор мен аналогты цифрлық түрлендіру (ADC) жүйесі алдыңғы шашыраңқы жарық (FSC) және бүйірлік шашыраңқы жарық (SSC) аналогты өлшеулерін, сондай-ақ бояуларға тән флуоресценттік сигналдарды компьютермен өңделетін цифрлық сигналдарға айналдырады. Күшейткіш жүйесі сызықтық немесе логарифмдік болуы мүмкін. Ағын цитометрін пайдалана отырып, үлгілерден деректерді жинау процесі «жинау» деп аталады. Жинау цитометрмен физикалық байланыстағы компьютермен және цитометрмен цифрлық интерфейсті басқаратын бағдарламалық жасақтамамен жүзеге асырылады. Бағдарламалық қамтамасыз ету сыналатын үлгі үшін параметрлерді (мысалы, кернеу, компенсация) реттеуге қабілетті, сондай-ақ параметрлердің дұрыс орнатылғанын қамтамасыз ету үшін үлгі деректерін жинау кезінде бастапқы үлгі ақпаратын көрсетуге көмектеседі. Алғашқы ағын цитометрлері, жалпы алғанда, тәжірибелік құрылғылар болды, бірақ технологиялық жетістіктер клиникалық және ғылыми-зерттеу мақсаттарында кеңінен қолданылуға мүмкіндік берді. Осы дамудың нәтижесінде аспаптар, талдау бағдарламалық жасақтамасы, сондай-ақ флуоресценттік белгісі бар антителолар сияқты жинау кезінде қолданылатын реагенттер үшін едәуір нарық пайда болды. Қазіргі заманғы аспаптарда, әдетте, бірнеше лазерлер мен флуоресценция детекторлары бар. Қазіргі уақытта коммерциялық аспаптар үшін рекордтық көрсеткіш – он лазер және 30 флуоресценция детекторы. Лазерлер мен детекторлардың санын арттыру бірнеше антиденелерді таңбалауға мүмкіндік береді және мақсатты популяцияны олардың фенотиптік маркерімен дәл анықтауға мүмкіндік береді. Кейбір аспаптар тіпті жеке жасушалардың цифрлық суреттерін түсіре алады, бұл жасушалар ішіндегі немесе олардың бетіндегі флуоресценттік сигналдың орналасуын талдауға мүмкіндік береді.

Modern flow cytometers are able to analyze many thousands of particles per second, in "real time" and, if configured as cell sorters, can actively separate and isolate particles with specified optical properties at similar rates. A flow cytometer is similar to a microscope, except that, instead of producing an image of the cell, flow cytometry offers high throughput, automated quantification of specified optical parameters on a cell by cell basis. To analyze solid tissues, a single cell suspension must first be prepared. A flow cytometer has five main components: a flow cell, a measuring system, a detector, an amplification system, and a computer for analysis of the signals. The flow cell has a liquid stream (sheath fluid), which carries and aligns the cells so that they pass single file through the light beam for sensing. The measuring system commonly uses measurement of impedance (or conductivity) and optical systems – lamps (mercury, xenon); high power water cooled lasers (argon, krypton, dye laser); low power air cooled lasers (argon (488 nm), red HeNe (633 nm), green HeNe, HeCd (UV)); diode lasers (blue, green, red, violet) resulting in light signals. The detector and analog to digital conversion (ADC) system converts analog measurements of forward scattered light (FSC) and side scattered light (SSC) as well as dye specific fluorescence signals into digital signals that can be processed by a computer. The amplification system can be linear or logarithmic. The process of collecting data from samples using the flow cytometer is termed "acquisition". Acquisition is mediated by a computer physically connected to the flow cytometer, and the software which handles the digital interface with the cytometer. The software is capable of adjusting parameters (e. g., voltage, compensation) for the sample being tested, and also assists in displaying initial sample information while acquiring sample data to ensure that parameters are set correctly. Early flow cytometers were, in general, experimental devices, but technological advances have enabled widespread applications for use in a variety of both clinical and research purposes. Due to these developments, a considerable market for instrumentation, analysis software, as well as the reagents used in acquisition such as fluorescently labeled antibodies have been developed. Modern instruments usually have multiple lasers and fluorescence detectors. The current record for a commercial instrument is ten lasers and 30 fluorescence detectors. Increasing the number of lasers and detectors allows for multiple antibody labeling, and can more precisely identify a target population by their phenotypic markers. Certain instruments can even take digital images of individual cells, allowing for the analysis of fluorescent signal location within or on the surface of cells.

Ағын цитометрінің сұйықтық жүйесі

Ұяшықтардың оптикалық қасиеттерін кез келген ағын цитометрінде дәл өлшеу үшін, ұяшықтар шоғырланған лазер сәулелерінің ортасынан біркелкі өтуі тиіс. Сұйықтық жүйесінің мақсаты – ұяшықтарды лазер сәулесі арқылы бірінен соң бірі жылжытып, құралдың ішінде жылжыту. Ұяшықтарды сұрыптау мүмкіндігі бар ағын цитометріндегі сұйықтықтар, сұрыпталған ұяшықтарды жинау түтіктеріне немесе ұяшықтарға жеткізу үшін осы ағынды пайдаланады. Бұл әрбір бөлшектің толық спектрін өлшеуге мүмкіндік береді. Жеке ұяшықтардан алынған өлшенген спектрлер, қолданылған барлық бояулардың және автофлюоресценция спектрінің анықтамалық спектрлерін пайдаланып, бөлінеді. Бұл кеңірек панельдерді құруға және жаңа биологиялық маркерлерді қолдануға мүмкіндік береді.

Суретке түсіретін ағын цитометриясы

Бейнелеу ағыны цитометриясы (IFC) жасушалардың көп арналы суреттерін түсіреді. Суреттеу платформаларында қолданылатын детектерлер жеке жасушалардың суреттерін түсіру үшін зарядталған құрылғы (CCD) немесе толықтырылған металл-оксид-жартылайөткізгіш (CMOS) құрылғыларымен жабдықталуы мүмкін.

Өтемақы

Әрбір флюорохром кең флуоресценция спектріне ие. Бірден көп фторхром қолданылғанда, фторхромдардың спектрі қабаттасуы мүмкін. Бұл жағдай спектрлік қабаттасу деп аталады. Бұл жағдайды жою қажет. Мысалы, FITC және PE үшін эмиссия спектрінде флуоресцеиннен шыққан жарық PE үшін қолданылатын фильтр арқылы өтетін толқын ұзындығымен қабаттасады. Бұл спектрлік қабаттасу FITC сигналының бір бөлігін PE сигналдарынан, немесе керісінше алып тастау арқылы түзетіледі. Бұл процесс түс компенсациясы деп аталады, ол фторхромды өзін-өзі өлшеу үшін проценттік мәнге айналдырады. Компенсация – көп параметрлі ағын цитометриялық деректердің спектрлік қабаттасуын түзетуге арналған математикалық процесс. Флюорохромдардың кең спектрі болуына байланысты, олар қабаттасып, деректерді талдау кезінде шатасуға алып келуі мүмкін. Бұл қабаттасу "шашырау" деп аталады және шашырау коэффициентімен өлшенеді, әдетте, белгілі бір флюорохромға арналған детекторлар басқа флюорохромнан шыққан жарықтың маңызды толқын ұзындығын өлшеуінен туындайды. Бұл түзетуді жасау үшін көбінесе сызықтық алгебра қолданылады. Графиктер көбінесе логарифмдік шкалаларда салынады. Әртүрлі флуоресценттік бояулардың эмиссия спектрлері қабаттасқандықтан, детекторлардағы сигналдар электрондық және есептеу арқылы компенсациялануы керек. Ағын цитометрі арқылы жиналған деректерді бағдарламалық жасақтама арқылы талдауға болады. Деректер жиналғаннан кейін, ағын цитометріне қосылудың қажеті жоқ және талдау көбінесе жеке компьютерде жүргізіледі. Бұл, әсіресе, осы құрылғыларға сұраныс жоғары болғандағы негізгі зертханаларда қажет.

Есептеулік талдау

Соңғы уақытта есептеу әдістерін қолдана отырып, халықты автоматты түрде анықтаудағы прогресс дәстүрлі қақпалық стратегияларға балама ұсынды. Автоматтандырылған сәйкестендіру жүйелері сирек және жасырын популяцияларды табуға көмектесе алады. Автоматтандырылған әдістердің мысалдары: Иммунология дерекқоры және талдау порталында (ImmPort) FLOCK, Bioconductor-да SamSPECTRAL және flowClust, ал GenePattern-де FLAME. T-бөлінген стохастикалық көршілік кіріктіру (tSNE) – бұл күрделі көп өлшемді деректерді екі өлшемді "картада" визуализациялауға мүмкіндік беретін өлшемділікті азайтуға арналған алгоритм. Бірлескен күш-жігердің нәтижесінде FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods) деп аталатын ашық жоба құрылды, ол ағын цитометриясы деректерін кластерлеу әдістерін салыстыру және бағалау үшін объективті тәсіл ұсынумен қатар, осы әдістерді тиімді пайдалану және қолдану жөніндегі ұсынымдарды әзірлеуді де мақсат етеді.

FMO бақылауы

Флуоресценция минус бір (FMO) бақылаулары көп түсті панельдер құрастырғанда деректерді интерпретациялау үшін маңызды – онда жасуша бір уақытта бірнеше флуорохроммен боялады. FMO бақылаулары белгілі бір арнадағы флуоресценцияның таралуын өлшеуге және компенсация жасауға мүмкіндік береді. FMO бақылауын жасау үшін, сыналып жатқан флуорохромнан басқа барлық флуорохромдармен боялған сынама қолданылады – яғни, егер сіз 4 түрлі флуорохромды қолдансаңыз, FMO бақылауыңызда олардың тек 3-і болуы керек (мысалы: флуорохромдар – A, B, C, D; FMO – ABC, ABD, ACD, BCD).

Ұяшықтарды ағын цитометриясымен сұрыптау

Жасушаларды сұрыптау – нақты физикалық қасиеттерінің болуы немесе болмауына негізделген жасуша популяциясын тазарту әдісі. Сорттай алатын ағын цитометрлерінде құрал жасуша өлшемі, морфологиясы және белок экспрессиясы сияқты параметрлерді пайдаланып жасушаларды анықтайды, содан кейін жасушаларды сұрыптау үшін тамшы технологиясын қолданып, эксперименттен кейін пайдалану үшін ішкі топтарды қалпына келтіреді. Тірі жасушаларды сұрыптаушы немесе флуоресценциялық белсенді жасушаларды сұрыптаушы (FACS) – Лен Герценбергтің жасаған нұсқасы, ол кейіннен 2006 жылы өзінің маңызды еңбегі үшін Киото сыйлығын жеңіп алды. Ағын цитометриялық жасуша сұрыптаушыларында ағын цитометриялық анализаторлардан өзгеше жинақтау жүйесі болады. Жинақтау процесі үлгіні қабықша сұйықтығының ағынына енгізгенде басталады, ол ағын ұяшығы мен лазердің арасынан өтеді. Содан кейін ағын жасушаны дірілдейтін саптама арқылы өткізеді, ол көбінесе бір жасушадан тұратын немесе жасушасыз тамшыларды жасайды. Электрлік зарядтау сақинасы ағын тамшыларға бөлінетін жерге орналастырылады және флуоресценция қарқындылығы өлшенуге бірден бұрын сақинаға заряд беріледі; тамшы ағыннан бөлінген кезде капшықта қарсы заряд жиналады, сондықтан тамшылар зарядталады. Зарядталған тамшылар кейін электрлік бұрылыс жүйесі арқылы түсіп, зарядтарына қарай контейнерлерге бағытталады. Кейбір жүйелерде заряд тікелей ағынға қолданылады, ал тамшы үзілгенде ағынның таңбасына сәйкес зарядты сақтайды. Тамшы бөлінгеннен кейін ағын бейтарап күйге қайта оралады. Жинағаннан кейін бұл жасушаларды одан әрі өсіруге, манипуляциялауға және зерттеуге болады.

Жазбалар

Ағын цитометриясы жасушалар немесе бөлшектерден шашыраған жарықтың қасиеттерін пайдаланып, физикалық қасиеттерді анықтауға немесе сандық өлшеуге мүмкіндік береді. Көп параметрілі талдау (жасуша туралы көбірек қасиеттерді түсіну) үшін таңбалар, бояулар және лактар қолданылуы мүмкін. Иммунофенотипі - бұл белгіленген антиденелер және бояулар сияқты флюорофорлы реагенттерді пайдалана отырып, жасушалардың әртүрлі популяцияларын талдау.

Флуоресцентті этикеткалар

Ағын цитометрияда флюорофорлардың кең спектрі таңбалау үшін қолданылуы мүмкін. Ең көп ажыратылатын флуоресценттік таңбалардың саны 17 немесе 18 деп саналады, ал мұндай күрделілік артефакттарды шектеу үшін көп еңбекті қажет ететін оптимизацияны, сондай-ақ үстіне жатқан спектрлерді бөлу үшін күрделі деконволюция алгоритмдерін талап етеді. Ағын цитометриясы флуоресценцияны сандық құрал ретінде пайдаланады; ағын цитометриясының жоғары сезімталдығы конфокалды микроскопия сияқты басқа флуоресценттік анықтау платформаларымен салыстыруға келмейді. Конфокалды микроскопияда абсолюттік флуоресценция сезімталдығы көбінесе төмен болады, себебі конфокалды оптикалық жүйе фокустан тыс сигналдарды жоққа шығарады және кескін жасушаның әр нүктесіндегі жеке өлшемдердің тізбегінен құралады, бұл сигналды жинауға жұмсалатын уақытты қысқартады.

Кванттық нүктелер

Кванттық нүктелер дәстүрлі флюорофорлардың орнына кейде олардың тар шығару спектрінің болуына байланысты қолданылады.

Изотоптық таңбалау

Массалық цитометрия антиденелерге бекітілген лантаноид изотоптарын қолдану арқылы флуоресценттік таңбалау шегін асып түседі. Бұл әдіс теориялық тұрғыдан 40-тан 60-қа дейін ажыратылатын таңбаларды пайдалануға мүмкіндік береді және 30 таңбаға қолданылғаны көрсетілген. Бұл патенттелген технология жасушаларды жоғары дәлдікпен талдауға мүмкіндік береді және мембрана сыйымдылығы және тірілік сияқты қосымша мәліметтерді ұсынады. Оның салыстырмалы түрде шағын мөлшері мен сенімділігі батареямен жұмыс істейтін дала жағдайында қолдануға мүмкіндік береді.

Өлшеуге болатын параметрлер

Жасушалық талдау және ағын цитометриясында өлшенетін факторлар жасуша биологиясы және функциясы туралы маңызды түсінік беретін әртүрлі қасиеттер мен көрсеткіштерді қамтиды. Ағын цитометриясы әдістері осы факторларды сандық өлшеуге және бағалауға мүмкіндік береді, бұл зерттеушілерге жасушалардың әртүрлі аспектілерін зерттеуге және талдауға мүмкіндік береді. Міне, зерттелетін маңызды сандық параметрлердің кейбіреулері:

Апоптоз: Апоптозды ДНК-ның жойылуын, митохондриялық мембраналық потенциалды, өткізгіштіктің өзгеруін және каспаза белсенділігін өлшеу арқылы ағын цитометриясымен анықтауға болады. Бұл өлшемдер жоспарланған жасуша өлімі туралы маңызды мәліметтерді ашады. Жасушаның жабысуы: Ағын цитометриясын патогеннің жасуша-иесіне жабысуы сияқты жасушаның жабысуын зерттеу үшін қолдануға болады. Зерттеушілер нақты маркерлерді немесе флуоресценттік таңбаларды пайдалану арқылы жасушалардың жабысу оқиғаларын сандық өлшеуге және талдауға болады. Жасуша пигменттері: Хлорофилл және фикоэритрин – белгілі бір жасушаларда кездесетін пигменттер. Бұл пигменттердің болуын және мөлшерін ағын цитометриясымен өлшеуге болады, бұл жасушалық метаболизм және физиологиялық күй туралы ақпарат береді. Жасуша бетіндегі антигендер: Ағын цитометриясы жасуша бетіндегі антигендерді анықтау және сандық өлшеу үшін жиі қолданылады, олар дифференциация кластері (CD) маркерлері деп те аталады. Зерттеушілер нақты антиденелермен жасушаларды таңбалау арқылы жасуша популяцияларын беткі антиген экспрессиясына сүйене отырып жіктеуге болады. Жасушаның тірі қалу қабілеті: Ағын цитометриясын тірі және өлі жасушаларды ажырататын флуоресценттік бояулар немесе маркерлерді пайдалану арқылы жасушаның тірі қалу қабілетін анықтау үшін қолдануға болады. Бұл параметр жасушаның денсаулығын және эксперименттік немесе терапиялық жағдайларға жауап беруін анықтау үшін маңызды. Ағын цитометриясында жасушалардың тірі қалу қабілеті 95%-ға жуық болуы керек, бірақ 90%-дан кем болмауы тиіс. Айналымдағы ісік жасушалары: Ағын цитометриясы қан үлгілерінен айналымдағы ісік жасушаларын (AIJ) оқшаулау және тазарту үшін маңызды. AIJ нақты маркерлер немесе ерекшеліктерге бағытталған зерттеулер арқылы анықталып, зерттеледі, бұл қатерлі ісік диагнозын, болжамын және емдеуді бақылауға көмектеседі. Көп дәрілік препараттарға қарсы тұруды сипаттау (КДТ): Ағын цитометриясы дәрілік препараттарға қарсы тұру механизмдерімен байланысты флуоресценттік бояулардың немесе нақты маркерлердің шығарылуын бағалау арқылы қатерлі ісік жасушаларында көп дәрілік препараттарға қарсы тұруды (КДТ) сипаттау үшін қолданылады. Бұл білім қатерлі ісікке қарсы емдеуде дәрілерге төзімділікті түсінуге және оны жеңуге көмектеседі. Хромосомалық талдау және сұрыптау: Ағын цитометриясы хромосомалық талдау және сұрыптауға көмектеседі, кітапханаларды құруға және нақты хромосомаларды немесе хромосомалық аномалияларды анықтауға мүмкіндік береді. ДНҚ көшірме санының өзгеруі: ДНҚ көшірме санының өзгеруін Flow FISH немесе Beads-тегі BAC технологиясы сияқты ағын цитометрия әдістері арқылы өлшеуге болады. Бұл технологиялар қатерлі ісік сияқты аурулармен байланысты генетикалық өзгерістерді анықтауға мүмкіндік береді. Ақуыз экспрессиясы және өзгерістері: Флуоресценттік белгіленген антиденелер немесе зондтарды пайдалану арқылы ағын цитометриясы ақуыз экспрессиясының деңгейін және фосфорилирлеу сияқты өзгерістерді бағалауға мүмкіндік береді. Бұл параметр ақуыз функциясын және сигналдық желілерді жақсырақ түсінуге ықпал етеді. Мембрананың сұйықтығы: Ағын цитометриясы мембрананың сұйықтығын мембраналық сипаттамаларға сезімтал флуоресценттік зондтарды пайдалану арқылы анықтай алады. Бұл параметр жасуша мембраналарының динамикасы және функциясы туралы ақпарат береді. ДНҚ және РНҚ жалпы мазмұны: Ағын цитометриясы жасушалардағы ДНҚ және РНҚ жалпы мазмұнын өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл мәліметтер жасуша циклын талдау, көбеюді зерттеу және ген экспрессиясының өзгеруін анықтау үшін пайдалы. Жасушаішілік параметрлерді бақылау: Жасушаішілік факторларды ағын цитометриясымен өлшеуге болады, соның ішінде pH, жасушаішілік иондалған кальций және магний деңгейі, мембраналық потенциал, глутатион деңгейі және тотығу жарылысы. Бұл мәліметтер жасушалық метаболизм, сигнал беру және тотығу стресі туралы ақпарат береді. Жарық шашырауы: Ағын цитометриясында жасуша көлемін және морфологиялық күрделілігін бағалау үшін алдыңғы шашырауы (ASC) және бүйірлік шашырауы (BSC) өлшемдері қолданылады. Бұл көрсеткіштер жасушаның мөлшері, дөңгелектігі және пішінін сипаттайды. Трансгендік өнімдер: Ағын цитометриясы in vivo трансгендік өнімдерді бағау үшін пайдалы, әсіресе жасыл флуоресценттік ақуыз (ЖФА) немесе оның ұқсас нұсқалары сияқты флуоресценттік ақуыздарды. Бұл ғалымдарға ген экспрессиясын, ақуыз локализациясын және жасушалық динамиканы зерттеуге мүмкіндік береді. Әртүрлі комбинациялар: Ағын цитометриясы ДНҚ/беткі антигендер сияқты көптеген өлшенетін деректерді біріктіруге мүмкіндік береді, бұл биологиялық ерекшеліктер мен функцияларды толық түсінуге мүмкіндік береді.

Apoptosis: Apoptosis can be quantified by flow cytometry by measuring DNA destruction, mitochondrial membrane potential, permeability alterations, and caspase activity. These measurements reveal important details about planned cell death. Cell adherence: Flow cytometry can be used to investigate cell adherence, such as pathogen host cell adherence. Researchers can quantify and analyze cell adhesion events by utilizing particular markers or fluorescent tags. Cell pigments: Chlorophyll and phycoerythrin are pigments found in certain cells. The presence and amounts of these pigments can be measured by flow cytometry, providing information about cellular metabolism and physiological states. Cell surface antigens: Flow cytometry is often used to identify and quantify cell surface antigens, also known as Cluster of Differentiation (CD) markers. Researchers can classify cell populations based on surface antigen expression by labeling cells with specific antibodies. Cell viability: Flow cytometry can be used as a cell viability assay by utilizing fluorescent dyes or markers that distinguish between live and dead cells. This parameter is critical in determining cell health and response to experimental or therapeutic settings. Viability of the cells in flow cytometry should be around 95% but not less than 90%. Circulating tumor cells: Flow cytometry is essential for isolating and purifying circulating tumor cells (CTCs) from blood samples. CTCs can be discovered and examined by targeting certain markers or features, assisting in cancer diagnosis, prognosis, and treatment monitoring. Characterizing multidrug resistance (MDR): Flow cytometry can be used to characterize multidrug resistance (MDR) in cancer cells by assessing the efflux of fluorescent dyes or particular markers associated with drug resistance mechanisms. This knowledge aids in the understanding and battling of medication resistance in cancer treatment. Chromosome analysis and sorting: Flow cytometry can help with chromosome analysis and sorting, allowing for the creation of libraries and the identification of specific chromosomes or chromosomal abnormalities. DNA copy number variation: DNA copy number variation can be measured using flow cytometry techniques such as Flow FISH or BACs on Beads technology. These technologies shed light on genetic changes linked to diseases such as cancer. Protein expression and modifications: Using fluorescently labeled antibodies or probes, flow cytometry makes it possible to assess protein expression levels and alterations such as phosphorylation. This parameter contributes to a better understanding of protein function and signaling networks. Membrane fluidity: Flow cytometry can detect membrane fluidity by utilizing fluorescent probes that are sensitive to membrane characteristics. This parameter gives information on the dynamics and function of cell membranes. Total DNA and RNA content: Flow cytometry can measure total DNA and RNA content in cells. This data is useful for cell cycle analyses, proliferation investigations, and determining gene expression changes. Monitoring intracellular parameters: Intracellular factors can be measured by flow cytometry, including pH, intracellular ionized calcium and magnesium levels, membrane potential, glutathione levels, and oxidative burst. These data provide information about cellular metabolism, signaling, and oxidative stress. Light scattering: Forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) measures are used in flow cytometry to assess cell volume and morphological complexity, respectively. These metrics describe the size, granularity, and shape of cells. Transgenic products: Flow cytometry is useful for assessing transgenic products in vivo, particularly fluorescent proteins like as green fluorescent protein (GFP) or similar variations. This enables scientists to investigate gene expression, protein localisation, and cellular dynamics. Various combinations: Flow cytometry allows you to integrate many measurable data, such as DNA/surface antigens, to acquire a comprehensive understanding of biological features and functions.

Қолданбалар

Технология молекулалық биология, патология, иммунология, вирусология, өсімдік биологиясы және теңіз биологиясы сияқты көптеген салаларда қолданылады. Бұл әдіс медицинада, әсіресе трансплантация, гематология, ісік иммунологиясы және химиотерапия, пренатальдық диагностика, генетика және жынысты алдын ала анықтау үшін сперматозоидтарды сұрыптау саласында кеңінен қолданылады. Ағын цитометриясы ерлердің фертильдігін бағалау кезінде ДНК фрагментациясымен байланысты сперматозоидтардың аномалияларын анықтау үшін жиі қолданылады. Сонымен қатар, ол ДНК зақымдануын, каспазаның ыдырауын және апоптозды анықтау үшін зерттеулерде кеңінен пайдаланылады. Фотоакустикалық ағын цитометриясы көп дәріге төзімді бактерияларды (көбінесе MRSA) зерттеуде, боялған бактериофагтармен белгіленген қандағы бактерияларды анықтау, ажырату және сандық бағалау үшін қолданылады. Нейробиологияда жасуша бетіндегі және ішкі антигендердің бірмезгілде экспрессиясын талдауға болады. Микробиологияда GFP-кодтаушы транспозонмен (TnMHA) құрылған транспозон мутант кітапханаларын скринингтеу және сұрыптау немесе жасушаның тірі қалғандығын бағау үшін қолданылуы мүмкін. Белок инженериясында ағын цитометриясы ашытқы дисплейі және бактериялық дисплейімен бірге қолданылып, жасуша бетінде көрсетілген, қажетті қасиеттері бар белок варианттарын анықтауға көмектеседі. Ағын цитометриясының гистология мен IHC-ге қарағанда басты артықшылығы – антигендердің мөлшерін дәл өлшеу мүмкіндігі және әрбір жасушаны бірнеше антиденелермен бояу мүмкіндігі. Қазіргі зертханаларда әр жасушаға шамамен 10 антидене байланыстырылуы мүмкін. Бұл көрсеткіш массалық цитометрде 40-қа дейін өлшенгенмен салыстырғанда аз, бірақ оның құны жоғары және жылдамдығы төмен.

Су шаруашылығындағы зерттеулер

Су жүйелерінде ағын цитометриясы автофлюоресцентті жасушаларды немесе қосымша бояулармен флюоресцентті таңбаланған жасушаларды талдау үшін қолданылады. Бұл зерттеу 1981 жылы Кларис Йенч қызыл су құрайтын динофлагелляттардың флуоресценциясын өлшеу үшін ағын цитометриясын қолданғанда басталды. Келесі жылы зерттеушілер флуоресценттік қасиеттеріне сәйкес ажыратуға болатын бірнеше түрлі балдырлардың ағын цитометриялық өлшемдерін жариялады. 1983 жылға қарай теңіз зерттеушілері өздерінің ағын цитометрлерін құрастырып немесе Бермудадан алынған теңіз суының үлгілерінде коммерциялық ағын цитометрлерін пайдаланып, фитопланктон жасушаларын тірі емес материалдардан ажыратуға болатынын, ал цианобактерияларды аралас популяциядан сұрыптап, кейіннен зертханада өсіруге болатынын көрсетті. Ағын цитометриясы теңіз зерттеушілеріне әлсіз флуоресценциялайтын Prochlorococcus және гетеротрофты микроорганизмдерді ажыратуға мүмкіндік берді, бұл микроскопиялық бағалаулармен анықтау қиын. Технологияның жетістіктері су ғалымдарына зерттеу круиздері кезінде ағын цитометрлерін үздіксіз пайдалануға мүмкіндік береді, ал ағын цитометрлері жеке фитопланктон жасушаларының суреттерін алу үшін қолданылады. Теңіз ғалымдары ағын цитометрлерінің сұрыптау мүмкіндігін жасушалық белсенділік пен әртүрліліктің дискретті өлшемдерін жүргізу үшін, жақын жерде өмір сүретін микроорганизмдер арасындағы өзара қарым-қатынастарды зерттеу үшін және мұхиттағы бірнеше процестердің биогеохимиялық деңгейін өлшеу үшін пайдаланады.

Жасушалардың көбеюін тексеру

Жасушалардың көбеюі иммундық жүйенің басты функциясы болып табылады. Көбінесе, кейбір қорытындылар жасау үшін жасушалардың көбею сипатын талдау қажет. Жасушалардың көбеюін анықтауға арналған әдістердің бірі – карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидил эфирі (CFSE) іздеуші бояуы. Ол көбеюші жасушаларды қадағалауға көмектеседі. Бұл әдіс уақытқа қатысты тәжірибелер кезінде сандық және сапалық мәліметтерді ұсынады. Бұл бояу жасуша ішінде ұзақ өмір сүретін молекулалармен ковалентті байланысады. Жасушалар бөлінген кезде молекулалар да бөлінеді, ал туынды жасушалар аналық жасушалар популяциясына қарағанда бояудың жартысына ие болады. Бұл интенсивтіліктің төмендеуін ағын цитометриясы арқылы бақылауға болады. Әдебиетте бұл қуатты ағын цитометриясы және CFSE әдісі лейкемия сияқты қатерлі ісіктердегі мақсатты жасушаларды өлтірудегі T-жасушалардың тиімділігін анықтау үшін қолданылған. Мақсатты жасушалардың жылдам және баяу өлімін көрнеулендіру үшін ғалымдар CFSE белгілеуін, белгілі бір жасушаларға антиденемен бояуды және флуоресцентті микрошарларды қолданды. Бұл сондай-ақ, белгілі бір цитокиндермен емдеген кезде мақсатты жасушалардың көбеюі туралы ақпаратты да берді.

Геномның өлшемін өлшеу

Ағын цитометриясы геном мөлшерін, немесе дәлірек айтқанда, жасушадағы немесе ядродағы ДНҚ мөлшерін өлшеу үшін қолданылады. Геномдарды геномдық тізбектеу арқылы одан да дәл талдауға болады, бірақ бұл көбінесе жоғары мөлшердегі микрохромосомалар немесе тізбектеу кезінде жіберіліп қалуы мүмкін қайталанатын тізбектер (немесе талдау кезеңінде хромосомаларға жатқызылмағандықтан сүзіліп қалады) салдарынан қиынға соғады. Дегенмен, ағын цитометриясы да мүлтіксіз емес. Алынған геном мөлшері қолданылған бояуға байланысты өзгеруі мүмкін. Балық геномдарын талдау кезінде пропидий йодиді (PI) және DAPI қолданғанда геном мөлшерінде айқын айырмашылықтар байқалды. Мысалы, Anguilla japonica геномы PI арқылы өлшенгенде 1,09 пг ДНҚ, ал DAPI арқылы өлшенгенде 1,25 пг құрады. Сол сияқты, Myxocyprinus asiaticus геномында 2,75 пг ДНҚ (PI) және 3,08 пг (DAPI) анықталды. Яғни, айырмашылық 12–14% шамасында болды.