Введение

Лабораторная техника в биологии и химии

Проточная цитометрия (ПЦ) – это метод, используемый для обнаружения и измерения физических и химических характеристик популяции клеток или частиц. В этом процессе образец, содержащий клетки или частицы, суспендируется в жидкости и вводится в прибор проточного цитометра. Образец фокусируется таким образом, чтобы клетки проходили через лазерный луч по одной, где рассеянный свет является характеристичным для клеток и их компонентов. Клетки часто маркируют флуоресцентными метками, благодаря чему свет поглощается и затем излучается в определенном диапазоне длин волн. Десятки тысяч клеток могут быть быстро проанализированы, а собранные данные обрабатываются компьютером. Проточная цитометрия широко используется в фундаментальных исследованиях, клинической практике и клинических испытаниях. Области применения проточной цитометрии включают:

Подсчет клеток
Сортировка клеток
Определение характеристик и функций клеток
Обнаружение микроорганизмов
Выявление биомаркеров
Выявление результатов протеиновой инженерии
Диагностика заболеваний, таких как рак крови
Измерение размера генома

Проточный цитометрический анализатор – это прибор, предоставляющий количественные данные по образцу. Другие приборы, использующие проточную цитометрию, включают клеточные сортери, которые физически разделяют и тем самым очищают интересующие клетки на основе их оптических свойств.

Наименование технологии

Первоначальное название технологии проточной цитометрии, основанной на флуоресценции, было "импульсная цитофотометрия" (нем. Impulszytophotometrie), что восходит к первой патентной заявке на проточную цитометрию, основанную на флуоресценции. На 5-й конференции Американского инженерного фонда по автоматизированной цитологии в Пенсаколе (Флорида) в 1976 году – спустя восемь лет после появления первого флуоресцентного проточного цитометра (1968) – было принято общее использование названия "проточная цитометрия", термин, который быстро получил широкое распространение.

Цитометры потока

Современные проточные цитометры способны анализировать многие тысячи частиц в секунду в режиме "реального времени" и, если сконфигурированы как сортер, могут активно разделять и изолировать частицы с заданными оптическими свойствами с аналогичной скоростью. Проточный цитометр похож на микроскоп, за исключением того, что вместо получения изображения клетки, проточная цитометрия обеспечивает высокопроизводительное, автоматизированное количественное определение заданных оптических параметров на клеточном уровне. Для анализа твердых тканей необходимо предварительно приготовить суспензию отдельных клеток. Проточный цитометр состоит из пяти основных компонентов: проточной ячейки, измерительной системы, детектора, системы усиления и компьютера для анализа сигналов. Проточная ячейка содержит поток жидкости (омывающая жидкость), который переносит и выравнивает клетки, обеспечивая их прохождение по световому лучу для регистрации в один ряд. Измерительная система обычно использует измерение импеданса (или проводимости) и оптические системы – лампы (ртутные, ксеноновые); мощные лазеры с водяным охлаждением (аргоновые, криптоновые, лазеры на красителях); маломощные лазеры с воздушным охлаждением (аргоновые (488 нм), красные HeNe (633 нм), зеленые HeNe, HeCd (УФ)); диодные лазеры (синие, зеленые, красные, фиолетовые), генерирующие световые сигналы. Детектор и система аналого-цифрового преобразования (АЦП) преобразуют аналоговые измерения прямого рассеяния света (FSC) и бокового рассеяния света (SSC), а также флуоресцентные сигналы, специфичные для красителей, в цифровые сигналы, которые могут быть обработаны компьютером. Система усиления может быть линейной или логарифмической. Процесс сбора данных из образцов с помощью проточного цитометра называется "аквизицией". Аквизиция осуществляется с помощью компьютера, физически подключенного к цитометру, и программного обеспечения, которое обеспечивает цифровой интерфейс с цитометром. Программное обеспечение способно регулировать параметры (например, напряжение, компенсацию) для анализируемого образца, а также отображать предварительную информацию об образце во время аквизиции данных, чтобы обеспечить правильную настройку параметров. Первые проточные цитометры, как правило, были экспериментальными устройствами, но технологические достижения позволили расширить область их применения в различных клинических и исследовательских целях. Благодаря этим разработкам сформировался значительный рынок приборов, программного обеспечения для анализа, а также реагентов, используемых при аквизиции, таких как флуоресцентно-меченые антитела. Современные приборы обычно оснащены несколькими лазерами и флуоресцентными детекторами. Текущий рекорд для коммерческого прибора – десять лазеров и 30 флуоресцентных детекторов. Увеличение числа лазеров и детекторов позволяет использовать множественную маркировку антителами и более точно идентифицировать целевую популяцию по ее фенотипическим маркерам. Некоторые приборы могут даже получать цифровые изображения отдельных клеток, что позволяет анализировать локализацию флуоресцентного сигнала внутри или на поверхности клеток.

Система цитометра потока

Клетки должны равномерно проходить через центр сфокусированных лазерных лучей для точного измерения оптических свойств клеток в любом проточном цитометре. Задача флюидной системы – перемещать клетки по одной через лазерный луч и по всему прибору. Флюидика в проточном цитометре с функцией сортировки также использует поток для доставки отсортированных клеток в пробирки или лунки для сбора. Это позволяет измерять полные спектры каждой частицы. Полученные спектры отдельных клеток впоследствии разделяются на компоненты с использованием эталонных спектров всех используемых красителей и спектра аутофлуоресценции. Это может позволить создавать более широкие панели и использовать новые биологические маркеры.

Образование изображений поточной цитометрии

Иммунофенотипическая проточная цитометрия (IFC) позволяет получать многоканальные изображения клеток. Детекторы, используемые в платформах визуализации, могут быть оснащены приборами с зарядовой связью (CCD) или комплементарными металл-оксид-полупроводниковыми (CMOS) сенсорами для захвата изображений отдельных клеток.

Компенсация

Каждый флуорохром имеет широкий спектр флуоресценции. При использовании нескольких флуорохромов возможно перекрытие спектров. Эта ситуация называется перекрытием спектров. Это перекрытие необходимо устранить. Например, спектр эмиссии FITC и PE таков, что свет, излучаемый флуоресцеином, попадает в ту же область длин волн, что и свет, проходящий через фильтр, используемый для PE. Это спектральное перекрытие корректируется путем вычитания части сигнала FITC из сигнала PE или наоборот. Этот процесс называется цветовой компенсацией, которая рассчитывает вклад каждого флуорохрома в процентном выражении. Компенсация – это математический процесс, используемый для коррекции перекрытия спектров в многопараметрических данных проточной цитометрии. Поскольку флуорохромы могут иметь широкий спектр, они могут перекрываться, что приводит к нежелательной путанице при анализе данных. Это перекрытие, известное как "перетекание" (spillover) и количественно оцениваемое коэффициентом перетекания, обычно возникает из-за того, что детекторы, предназначенные для регистрации сигнала определенного флуорохрома, фиксируют значительный пик длины волны от другого флуорохрома. Для выполнения этой коррекции чаще всего используется линейная алгебра. Графики часто строятся в логарифмическом масштабе. Поскольку спектры эмиссии различных флуоресцентных красителей перекрываются, сигналы детекторов необходимо компенсировать как электронным, так и вычислительным путем. Данные, полученные с помощью проточного цитометра, можно анализировать с помощью программного обеспечения. После сбора данных нет необходимости оставаться подключенным к цитометру, и анализ чаще всего выполняется на отдельном компьютере. Это особенно важно в централизованных лабораториях, где эти приборы пользуются высоким спросом.

Вычислительный анализ

Недавний прогресс в автоматизированной идентификации клеток с использованием вычислительных методов предложил альтернативу традиционным стратегиям ручной разграничения популяций. Автоматизированные системы идентификации потенциально могут помочь в выявлении редких и скрытых популяций. К числу типичных автоматизированных методов относятся FLOCK в Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort), SamSPECTRAL и flowClust в Bioconductor, и FLAME в GenePattern. T Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) – это алгоритм, разработанный для снижения размерности, позволяющий визуализировать сложные многомерные данные в виде двухмерной "карты". Благодаря совместным усилиям был создан открытый проект FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods), призванный обеспечить объективный способ сравнения и оценки методов кластеризации данных проточной цитометрии, а также разработать рекомендации по их правильному использованию и применению.

Контроль ФМО

Контроли "флуоресценция минус один" (FMO) важны для интерпретации данных при создании многоцветных панелей, в которых клетки окрашиваются одновременно несколькими флуорохромами. Контроли FMO позволяют оценить перетекание флуоресценции в конкретный канал и выполнить компенсацию. Для создания FMO-контроля образец окрашивают всеми флуорохромами, кроме одного, который тестируется – то есть, если вы используете 4 различных флуорохрома, ваш FMO-контроль должен содержать только 3 из них (например: флуорохромы – A, B, C, D; FMO – ABC, ABD, ACD, BCD).

Сортировка клеток по проточной цитометрии

Сортировка клеток – это метод очистки клеточных популяций на основе наличия или отсутствия определенных физических характеристик. В потовых цитометрах с функцией сортировки прибор обнаруживает клетки, используя параметры, такие как размер клетки, морфология и экспрессия белка, а затем применяет технологию капель для сортировки клеток и получения субпопуляций для дальнейшего использования в экспериментах. Сортировщик живых клеток или сортировщик клеток с флуоресцентной активацией (FACS) был разработан Леном Герценбергом, который впоследствии получил Киотскую премию в 2006 году за его основополагающие работы. Потовые цитометры-сортировщики имеют систему сбора, в отличие от потовых цитометров-анализаторов. Процесс сбора начинается, когда образец вводится в поток буферного раствора, который проходит через проточную ячейку и пересекается лазерным лучом. Затем поток переносит клетку через вибрирующее сопло, которое формирует капли, большинство из которых содержат одну клетку или не содержат клеток вовсе. Электрическое заряжающее кольцо располагается непосредственно в точке, где поток распадается на капли, и заряд на кольцо подается непосредственно перед измерением интенсивности флуоресценции; противоположный заряд захватывается каплей при ее отрыве от потока, таким образом, капли приобретают заряд. Заряженные капли затем проходят через систему электростатического отклонения, которая направляет капли в соответствующие контейнеры в зависимости от их заряда. В некоторых системах заряд подается непосредственно на поток, и отрывающаяся капля сохраняет заряд того же знака, что и поток. После отрыва капли поток возвращается в нейтральное состояние. После сбора эти клетки можно культивировать, модифицировать и исследовать.

Этикетки

Потоковая цитометрия использует свойства света, рассеянного клетками или частицами, для идентификации или количественного измерения физических характеристик. Метки, красители и реагенты для окрашивания могут использоваться для многопараметрического анализа (определения большего числа характеристик клетки). Иммунофенотипирование – это анализ гетерогенных популяций клеток с использованием меченых антител и других флуорофорсодержащих реагентов, таких как красители и пятна.

Флуоресцентные этикетки

Широкий спектр флюорофоров может использоваться в качестве меток в проточном цитометрии. Считается, что максимальное количество различимых флуоресцентных меток составляет 17 или 18, и такая сложность требует кропотливой оптимизации для минимизации артефактов, а также сложных алгоритмов деконволюции для разделения перекрывающихся спектров. Проточная цитометрия использует флуоресценцию как количественный инструмент; предельная чувствительность проточной цитометрии не имеет себе равных среди других флуоресцентных платформ обнаружения, таких как конфокальная микроскопия. Абсолютная флуоресцентная чувствительность обычно ниже в конфокальной микроскопии, поскольку внефокусные сигналы отбрасываются конфокальной оптической системой и поскольку изображение формируется последовательно из отдельных измерений в каждой точке клетки, что уменьшает время, доступное для сбора сигнала.

Квантовые точки

Квантовые точки иногда используются вместо традиционных флюорофоров благодаря более узким пикам эмиссии.

Маркировка изотопов

Массовая цитометрия преодолевает ограничения флуоресцентной маркировки, используя изотопы лантаноидов, конъюгированные с антителами. Теоретически этот метод позволяет использовать от 40 до 60 различимых меток, и это было продемонстрировано для 30 меток. Эта запатентованная технология обеспечивает высокоточный анализ клеток и предоставляет дополнительную информацию, такую как емкостная характеристика мембраны и жизнеспособность клеток. Относительно небольшой размер и надежность позволяют использовать питание от батарей непосредственно на месте, в полевых условиях.

Измеримые параметры

Измеримые факторы в клеточном анализе и проточной цитометрии включают в себя разнообразный набор признаков и показателей, предоставляющих важную информацию о биологии и функциях клеток. Методы проточной цитометрии позволяют количественно оценивать эти факторы, что дает исследователям возможность изучать и анализировать различные аспекты клеток. Вот некоторые важные количественно определяемые параметры, которые часто исследуются:

Апоптоз: Апоптоз можно количественно оценить с помощью проточной цитометрии, измеряя разрушение ДНК, потенциал митохондриальной мембраны, изменения проницаемости и активность каспаз. Эти измерения предоставляют важные сведения о запрограммированной гибели клеток. Клеточная адгезия: Проточную цитометрию можно использовать для изучения клеточной адгезии, например, адгезии патогенных клеток к клеткам хозяина. Исследователи могут количественно оценить и проанализировать события клеточной адгезии, используя специфические маркеры или флуоресцентные метки. Клеточные пигменты: Хлорофилл и фикоэритрин – это пигменты, содержащиеся в определенных клетках. Наличие и количество этих пигментов можно измерить с помощью проточной цитометрии, что дает информацию о клеточном метаболизме и физиологическом состоянии. Антигены клеточной поверхности: Проточная цитометрия часто используется для идентификации и количественной оценки антигенов клеточной поверхности, также известных как маркеры кластеров дифференцировки (CD). Исследователи могут классифицировать популяции клеток на основе экспрессии поверхностных антигенов, метая клетки специфическими антителами. Жизнеспособность клеток: Проточную цитометрию можно использовать в качестве анализа жизнеспособности клеток, используя флуоресцентные красители или маркеры, которые различают живые и мертвые клетки. Этот параметр критически важен для определения здоровья клеток и их реакции на экспериментальные или терапевтические воздействия. Жизнеспособность клеток при проточной цитометрии должна составлять около 95%, но не менее 90%. Циркулирующие опухолевые клетки: Проточная цитометрия необходима для выделения и очистки циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из образцов крови. ЦОК можно обнаружить и исследовать, нацеливаясь на определенные маркеры или характеристики, что помогает в диагностике рака, прогнозировании и мониторинге лечения. Характеристика множественной лекарственной устойчивости (MDR): Проточную цитометрию можно использовать для характеристики множественной лекарственной устойчивости (MDR) в раковых клетках, оценивая выведение флуоресцентных красителей или определенных маркеров, связанных с механизмами лекарственной устойчивости. Эти знания помогают понять и преодолеть лекарственную устойчивость при лечении рака. Анализ и сортировка хромосом: Проточная цитометрия может помочь в анализе и сортировке хромосом, позволяя создавать библиотеки и идентифицировать конкретные хромосомы или хромосомные аномалии. Вариация числа копий ДНК: Вариацию числа копий ДНК можно измерить с помощью методов проточной цитометрии, таких как Flow FISH или технологии BACs on Beads. Эти технологии проливают свет на генетические изменения, связанные с такими заболеваниями, как рак. Экспрессия и модификации белков: С помощью флуоресцентно меченых антител или зондов проточная цитометрия позволяет оценить уровни экспрессии белков и изменения, такие как фосфорилирование. Этот параметр способствует лучшему пониманию функции белков и сигнальных сетей. Текучесть мембран: Проточная цитометрия может обнаруживать текучесть мембран, используя флуоресцентные зонды, чувствительные к характеристикам мембран. Этот параметр предоставляет информацию о динамике и функциях клеточных мембран. Общее содержание ДНК и РНК: Проточная цитометрия может измерять общее содержание ДНК и РНК в клетках. Эти данные полезны для анализа клеточного цикла, исследования пролиферации и определения изменений экспрессии генов. Мониторинг внутриклеточных параметров: Внутриклеточные факторы можно измерять с помощью проточной цитометрии, включая pH, внутриклеточные уровни ионизированного кальция и магния, мембранный потенциал, уровни глутатиона и окислительный всплеск. Эти данные предоставляют информацию о клеточном метаболизме, сигнализации и окислительном стрессе. Рассеяние света: Измерения прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) используются в проточной цитометрии для оценки объема клеток и морфологической сложности соответственно. Эти показатели описывают размер, гранулярность и форму клеток. Трансгенные продукты: Проточная цитометрия полезна для оценки трансгенных продуктов in vivo, особенно флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его аналоги. Это позволяет ученым изучать экспрессию генов, локализацию белков и клеточную динамику. Различные комбинации: Проточная цитометрия позволяет интегрировать множество измеримых данных, таких как ДНК/антигены поверхности, для получения всестороннего понимания биологических признаков и функций.

Приложения

Технология находит применение в ряде областей, включая молекулярную биологию, патологию, иммунологию, вирусологию, биологию растений и морскую биологию. Она имеет широкое применение в медицине, особенно в трансплантологии, гематологии, иммунологии опухолей и химиотерапии, пренатальной диагностике, генетике и сортировке спермы для пренатального определения пола. Проточная цитометрия широко используется для выявления аномалий сперматозоидов, связанных с фрагментацией ДНК, в анализах мужской фертильности. Также она широко применяется в исследованиях для обнаружения повреждений ДНК, расщепления каспаз и апоптоза. Фотоакустическая проточная цитометрия используется в изучении бактерий, устойчивых к множеству лекарств (наиболее часто MRSA), для обнаружения, дифференцирования и количественной оценки бактерий в крови, меченных окрашенными бактериофагами. В нейробиологии также можно анализировать коэкспрессию поверхностных и внутриклеточных антигенов. В микробиологии ее можно использовать для скрининга и сортировки библиотек транспозонных мутантов, созданных с использованием транспозона, кодирующего GFP (TnMHA), или для оценки жизнеспособности. В белковой инженерии проточная цитометрия используется в сочетании с дисплеем на дрожжах и дисплеем на бактериях для выявления вариантов белков, представленных на поверхности клетки, с желаемыми свойствами. Основными преимуществами проточной цитометрии перед гистологией и иммуногистохимией (IHC) являются возможность точного измерения количества антигенов и возможность окрашивания каждой клетки несколькими флуоресцентными антителами – в современных лабораториях к каждой клетке можно присоединить около 10 антител. Это значительно меньше, чем у масс-цитометров, где в настоящее время можно измерить до 40, но при более высокой стоимости и меньшей скорости анализа.

Водные исследования

В водных системах проточная цитометрия используется для анализа автофлуоресцирующих клеток или клеток, флуоресцентно меченных добавленными красителями. Эти исследования начались в 1981 году, когда Кларис Йенч использовала проточную цитометрию для измерения флуоресценции динофлагеллята, вызывающего красное цветение воды. В следующем году исследователи опубликовали результаты проточной цитометрии нескольких видов водорослей, которые можно было различить по их флуоресцентным характеристикам. К 1983 году морские исследователи собирали собственные проточные цитометры или использовали коммерчески доступные приборы для анализа образцов морской воды, собранных у Бермудских островов, чтобы продемонстрировать возможность различать клетки фитопланктона и неживой материал, а также выделять цианобактерии из смешанных сообществ с последующим культивированием в лаборатории. Проточная цитометрия также позволила морским исследователям различать слабо флуоресцирующие прохлорококки и гетеротрофные микроорганизмы, что затруднительно при микроскопических исследованиях. Современные технологические достижения позволяют ученым, работающим с водными экосистемами, использовать проточные цитометры непрерывно во время исследовательских круизов, а также получать изображения отдельных клеток фитопланктона. Морские ученые используют сортировочные возможности проточных цитометров для проведения дискретных измерений клеточной активности и разнообразия, изучения симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами, живущими в тесном контакте, и измерения биогеохимических скоростей различных процессов в океане.

Испытание пролиферации клеток

Пролиферация клеток – основная функция иммунной системы. Часто требуется анализировать пролиферативную способность клеток для получения определенных выводов. Одним из методов определения пролиферации клеток является использование отслеживающего красителя – карбоксифлуоресцеин диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE). Он позволяет контролировать пролиферирующие клетки. Этот метод предоставляет как количественные, так и качественные данные в ходе экспериментов, проводимых во времени. Краситель ковалентно связывается с долгоживущими молекулами внутри клетки. При делении клеток молекулы также делятся, и дочерние клетки содержат вдвое меньше красителя, чем родительская популяция. Это уменьшение интенсивности можно визуализировать с помощью проточной цитометрии. В научной литературе эта мощная комбинация проточной цитометрии и CFSE использовалась для оценки эффективности Т-клеток в уничтожении целевых клеток при раке, например, лейкемии. Для визуализации гибели целевых клеток, как быстрой, так и медленной, ученые использовали мечение CFSE в сочетании с окрашиванием антителами определенных типов клеток и флуоресцентно-мечеными микрочастицами. Это также позволило получить информацию о пролиферации целевых клеток под воздействием определенных цитокинов.

Измерение размера генома

Поточная цитометрия используется для измерения размеров генома, или, точнее, количества ДНК в клетке или ядре. Хотя геномы можно анализировать с большей точностью с помощью секвенирования, это часто бывает затруднительно из-за высокой доли микрохромосом или повторяющихся последовательностей, которые могут быть упущены при секвенировании (или отфильтрованы на этапе анализа, если их нельзя отнести к хромосомам). Однако, проточная цитометрия тоже не идеальна. Получаемые размеры генома могут различаться в зависимости от используемого красителя. Анализ геномов рыб показал значительные различия в размерах геномов при использовании пропидиум-йодида (PI) и DAPI. Например, в геноме японской угря (Anguilla japonica) было обнаружено 1,09 пг ДНК при использовании PI против 1,25 пг при использовании DAPI. Аналогично, в геноме Myxocyprinus asiaticus было обнаружено 2,75 пг ДНК (PI) против 3,08 пг (DAPI). Таким образом, разница составляла 12–14%.