Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Лактозаны метаболизмдеуге қажетті гендер, белоктар мен ферменттерді кодтайды.
Set genes encoding proteins and enzymes for lactose metabolism
Лактоза опероны (lac operon) – *E. coli* және көптеген басқа ішек бактерияларында лактозаның тасымалдануы мен метаболизмі үшін қажетті оперон. Көптеген ішек бактериялары үшін глюкоза басты көміртегі көзі болғанымен, лактоза опероны бета-галактозидазаның әрекеті арқылы глюкоза болмағанда лактозаны тиімді қорытуға мүмкіндік береді. Лак оперонының гендік реттелуі – генетикалық реттеу механизмінің алғаш рет толық түсіндірілгені, сондықтан ол прокариоттық гендік реттелудің маңызды мысалына айналды. Осы себепті бұл тақырып молекулалық және жасушалық биологияның кіріспе курстарында жиі талқыланады. Франсуа Якоб және Жак Моно осы лактоза метаболизмі жүйесін биологиялық жасушаның қай ферментті синтездеу керектігін қалай білетінін анықтау үшін пайдаланды. Олардың лак опероны бойынша жұмысы 1965 жылы физиология саласындағы Нобель сыйлығымен марапатталды. Лактоза болмаған жағдайда, *lacI* генімен кодталатын лактоза репрессоры лактоза оперонымен кодталатын ферменттер мен тасымалдау ақуыздарының өндірісін тоқтатады. Ол ДНК-ға тәуелді РНК полимеразаның жұмысын бұғаттайды. Бұл тоқтату толық емес, ген экспрессиясының минималды деңгейі үнемі жүріп тұрады. Репрессорлық ақуыз әрқашан экспрессияланады, бірақ лак опероны (ферменттер мен тасымалдау ақуыздары) реттелген күйде болады (бірақ толығымен тоқтатылмайды).
The lactose operon (lac operon) is an operon required for the transport and metabolism of lactose in E. coli and many other enteric bacteria. Although glucose is the preferred carbon source for most enteric bacteria, the lac operon allows for the effective digestion of lactose when glucose is not available through the activity of beta galactosidase. Gene regulation of the lac operon was the first genetic regulatory mechanism to be understood clearly, so it has become a foremost example of prokaryotic gene regulation. It is often discussed in introductory molecular and cellular biology classes for this reason. This lactose metabolism system was used by François Jacob and Jacques Monod to determine how a biological cell knows which enzyme to synthesize. Their work on the lac operon won them the Nobel Prize in Physiology in 1965. In the absence of lactose, the lac repressor, encoded by lacI, halts production of the enzymes and transport proteins encoded by the lac operon. It does so by blocking the DNA dependent RNA polymerase. This blocking/ halting is not perfect, and a minimal amount of gene expression does take place all the time. The repressor protein is always expressed, but the lac operon (enzymes and transport proteins) are repressed. (But not completely stopped)
Лактоза қолжетімді болғанда, бірақ глюкоза болмағанда, лактозаның бір бөлігі *lacY* генімен кодталатын бұрыннан бар тасымалдау ақуызы арқылы жасушаға енеді. Бұл лактоза репрессормен байланысып, оны инактивациялайды, соның нәтижесінде лак опероны экспрессияланады. Содан кейін β-галактозидтік пермеазаның көбірек синтезі жүреді, бұл одан да көп лактозаның енуіне мүмкіндік береді және *lacZ* және *lacA* гендерімен кодталатын ферменттер оны қорыта алады. Алайда, глюкозаның болуы кезінде, лактозаның болуына қарамастан, оперон реттеледі. Себебі ферменттерді өндіру үшін қажетті катаболитті активаторлық ақуыз (CAP) белсенді емес күйде қалады, ал EIIAGlc лактозаның жасушаға тасымалдануын болдырмау үшін лактоза пермеазасын тоқтатады. Бұл екі еселі бақылау механизмі глюкоза мен лактозаның екі бөлек өсу фазасында тікелей пайдаланылуына әкеледі, бұл диаукси деп аталады.
When lactose is available but not glucose, then some lactose enters the cell using pre existing transport protein encoded by lacY. This lactose then combines with the repressor and inactivates it, hence allowing the lac operon to be expressed. Then more β galactoside permease is synthesized allowing even more lactose to enter and the enzymes encoded by lacZ and lacA can digest it. However, In the presence of glucose, regardless of the presence of lactose, the operon will be repressed. This is because the catabolite activator protein (CAP), required for production of the enzymes, remains inactive, and EIIAGlc shuts down lactose permease to prevent transport of lactose into the cell. This dual control mechanism causes the sequential utilization of glucose and lactose in two distinct growth phases, known as diauxie.
Құрылымы
Лак опероны 3 құрылымдық геннен, сондай-ақ промотордан, терминатордан, регулятордан және оператордан тұрады. Үш құрылымдық ген: lacZ, lacY және lacA. lacZ β-галактозидазаны (LacZ) кодтайды, бұл клетка ішіндегі фермент, ол дисахарид лактозаны глюкоза мен галактозаға ыдыратады. lacY бета-галактозидтік пермеазаны (LacY) кодтайды, бұл трансмембраналық симпортер, протондық градиентті пайдаланып лактозаны қоса алғанда, β-галактозидтерді жасушаға бір бағытта тасымалдайды. Пермеаза жасушаның β-галактозидтерге өтімділігін арттырады. lacA β-галактозид трансацетилазасын (LacA) кодтайды, бұл фермент ацетил тобын ацетил-CoA-дан тиогалактозидке ауыстырады. Лактозаның катаболизмі үшін тек lacZ және lacY қажет болып көрінеді.
The lac operon consists of 3 structural genes, and a promoter, a terminator, regulator, and an operator. The three structural genes are: lacZ, lacY, and lacA. lacZ encodes β galactosidase (LacZ), an intracellular enzyme that cleaves the disaccharide lactose into glucose and galactose. lacY encodes Beta galactoside permease (LacY), a transmembrane symporter that pumps β galactosides including lactose into the cell using a proton gradient in the same direction. Permease increases the permeability of the cell to β galactosides. lacA encodes β galactoside transacetylase (LacA), an enzyme that transfers an acetyl group from acetyl CoA to thiogalactoside. Only lacZ and lacY appear to be necessary for lactose catabolic pathway.
Реттеу
Лак гендерін нақты бақылау бактерияға лактозаның субстрат ретінде қолжетімділігіне байланысты. Лактоза көміртек көзі ретінде қолжетімсіз болғанда бактериялар ақуыздарды өндірмейді. Лак гендері оперон құрамына кіреді, яғни хромосомада бір-біріне тікелей іргелес, бір бағытта орналасқан және бір полицистрондық мРНК молекуласына біріктіріліп транскрипцияланады. Барлық гендердің транскрипциясы ДНК-ға байланысатын белок – РНК полимеразаның (РНҚП) гендердің тікелей жоғары жағындағы нақты ДНК байланысу орнына – промоторға байланысуымен басталады. РНК полимеразаның промоторға байланысуына cAMP-ге байланысқан катаболит активаторы (CAP, сондай-ақ cAMP рецептор ақуызы деп те аталады) көмектеседі. Дегенмен, lacI гені (lac оперонының реттеуші гені) оперонның операторына РНҚП-ның байланысуын тежейтін белокты шығарады. Бұл белок тек аллолактозамен байланысқанда ғана алынып тасталады, ол оның белсенділігін жоғалтады. lacI генімен кодталатын белок лак репрессоры деп аталады. Лак оперонының реттелу түрі теріс индукцияланатын деп сипатталады, яғни ген реттеуші фактор (лак репрессоры) арқылы өшіріледі, егер қандай да бір молекула (лактоза) қосылмаса. Репрессор алынғаннан кейін, РНҚП барлық үш генді (lacZYA) мРНК-ға транскрипциялай бастайды. мРНК таспасындағы үш геннің әрқайсысының өзіндік Shine-Dalgarno тізбегі бар, сондықтан гендер тәуелсіз түрде аудармаланады. E. coli лак оперонының, lacZYA мРНК-ның және lacI гендерінің ДНҚ тізбегі GenBank-тан қолжетімді (көру). Бірінші реттеу механизмі – лактозаға жауап беру, ол лактозаның болмағанда β-галактозидазаның өндірісін тежеу үшін лактоза репрессоры деп аталатын ішкі жасушалық реттеуші белокты пайдаланады. Репрессорды кодтайтын lacI гені лак оперонының жанында орналасқан және әрқашан экспрессияланады (конститутивті). Егер лактоза өсу ортасынан жоқ болса, репрессор лак операторы деп аталатын промотордың төменгі жағындағы қысқа ДНК тізбегіне тығыз байланысады. Операторға байланысқан репрессор РНҚП-ның промоторға байланысуына кедергі келтіреді, сондықтан LacZ және LacY кодтайтын мРНК өте төмен деңгейде ғана түзіледі. Алайда, лактозаның қатысуымен жасушалар өскенде, лактозадан түзілген аллолактоза деп аталатын метаболит репрессормен байланысып, аллостериялық өзгеріске әкеледі. Осылайша өзгерген репрессор операторға байланыса алмайды, бұл РНҚП-қа лак гендерін транскрипциялауға мүмкіндік береді, соның салдарынан кодталған белоктардың деңгейі жоғарылайды. Екінші реттеу механизмі – глюкозаға жауап беру, ол глюкозаның болмағанда β-галактозидазаның өндірісін айтарлықтай арттыру үшін катаболит активаторы (CAP) гомодимерін пайдаланады. Циклді аденозин монофосфаты (cAMP) – таралуы глюкоза деңгейіне кері пропорционал болатын сигналдық молекула. Ол CAP-ке байланысады, бұл өз кезегінде CAP-ті CAP байланысу орнына байланысуға мүмкіндік береді (төмендегі суретте промотордан сол жақта 16 жұп негіздік ДНК тізбегі, транскрипция басталу орнынан шамамен 60 жұп негіз жоғары), бұл РНҚП-ның ДНК-ға байланысуына көмектеседі. Глюкоза болмаған жағдайда cAMP концентрациясы жоғары болады және CAP-cAMP-тың ДНК-мен байланысуы β-галактозидазаның өндірісін едәуір арттырады, бұл жасушаға лактозаны гидролиздеуге және галактоза мен глюкозаны босатуға мүмкіндік береді. Соңғы зерттеулер көрсеткендей, глюкозаның қатысуында индукторды алып тастау лак оперонының экспрессиясын тоқтатады. Глюкоза PEP-тәуелді фосфотрансфераза жүйесі арқылы жасушаға тасымалданады. Фосфоенолпируваттың фосфат тобы жалпы PTS (фосфотрансфераза жүйесі) ақуыздары HPr және EIA және глюкозаға тән PTS ақуыздары EIIAGlc және EIIBGlc, EII глюкоза тасымалдаушысының цитоплазмалық доменінен тұратын фосфорильдеу каскады арқылы беріледі. Глюкозаның тасымалдануына оның EIIBGlc арқылы фосфорилирленуі, басқа PTS ақуыздарынан, соның ішінде EIIAGlc-тен фосфат тобын алуы енеді. EIIAGlc-тің фосфорильденбеген түрі лак пермеазасымен байланысып, оның лактозаны жасушаға әкелуіне кедергі жасайды. Сондықтан, егер глюкоза және лактоза екеуі де болса, глюкозаның тасымалы лак оперонының индукторының тасымалын тоқтатады.
Specific control of the lac genes depends on the availability of the substrate lactose to the bacterium. The proteins are not produced by the bacterium when lactose is unavailable as a carbon source. The lac genes are organized into an operon; that is, they are oriented in the same direction immediately adjacent on the chromosome and are co transcribed into a single polycistronic mRNA molecule. Transcription of all genes starts with the binding of the enzyme RNA polymerase (RNAP), a DNA binding protein, which binds to a specific DNA binding site, the promoter, immediately upstream of the genes. Binding of RNA polymerase to the promoter is aided by the cAMP bound catabolite activator protein (CAP, also known as the cAMP receptor protein). However, the lacI gene (regulatory gene for lac operon) produces a protein that blocks RNAP from binding to the operator of the operon. This protein can only be removed when allolactose binds to it, and inactivates it. The protein that is formed by the lacI gene is known as the lac repressor. The type of regulation that the lac operon undergoes is referred to as negative inducible, meaning that the gene is turned off by the regulatory factor (lac repressor) unless some molecule (lactose) is added. Once the repressor is removed, RNAP then proceeds to transcribe all three genes (lacZYA) into mRNA. Each of the three genes on the mRNA strand has its own Shine Dalgarno sequence, so the genes are independently translated. The DNA sequence of the E. coli lac operon, the lacZYA mRNA, and the lacI genes are available from GenBank (view). The first control mechanism is the regulatory response to lactose, which uses an intracellular regulatory protein called the lactose repressor to hinder production of β galactosidase in the absence of lactose. The lacI gene coding for the repressor lies nearby the lac operon and is always expressed (constitutive). If lactose is missing from the growth medium, the repressor binds very tightly to a short DNA sequence just downstream of the promoter near the beginning of lacZ called the lac operator. The repressor binding to the operator interferes with binding of RNAP to the promoter, and therefore mRNA encoding LacZ and LacY is only made at very low levels. When cells are grown in the presence of lactose, however, a lactose metabolite called allolactose, made from lactose by the product of the lacZ gene, binds to the repressor, causing an allosteric shift. Thus altered, the repressor is unable to bind to the operator, allowing RNAP to transcribe the lac genes and thereby leading to higher levels of the encoded proteins. The second control mechanism is a response to glucose, which uses the catabolite activator protein (CAP) homodimer to greatly increase production of β galactosidase in the absence of glucose. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a signal molecule whose prevalence is inversely proportional to that of glucose. It binds to the CAP, which in turn allows the CAP to bind to the CAP binding site (a 16 bp DNA sequence upstream of the promoter on the left in the diagram below, about 60 bp upstream of the transcription start site), which assists the RNAP in binding to the DNA. In the absence of glucose, the cAMP concentration is high and binding of CAP cAMP to the DNA significantly increases the production of β galactosidase, enabling the cell to hydrolyse lactose and release galactose and glucose. More recently inducer exclusion was shown to block expression of the lac operon when glucose is present. Glucose is transported into the cell by the PEP dependent phosphotransferase system. The phosphate group of phosphoenolpyruvate is transferred via a phosphorylation cascade consisting of the general PTS (phosphotransferase system) proteins HPr and EIA and the glucose specific PTS proteins EIIAGlc and EIIBGlc, the cytoplasmic domain of the EII glucose transporter. Transport of glucose is accompanied by its phosphorylation by EIIBGlc, draining the phosphate group from the other PTS proteins, including EIIAGlc. The unphosphorylated form of EIIAGlc binds to the lac permease and prevents it from bringing lactose into the cell. Therefore, if both glucose and lactose are present, the transport of glucose blocks the transport of the inducer of the lac operon.
Репрессор құрылымы
Лак репрессоры – төрт бөліктен тұратын ақуыз, тетрамер, бірдей кішібірліктері бар. Әрбір кішібірлікте ДНК-ға байланысуға қабілетті спираль-бұрылыс-спираль (HTH) мотиві бар. Репрессор байланысатын операторлық орын – кері қайталану симметриясы бар ДНК тізбегі. Оператордың екі ДНК жартысы репрессордың екі кішібірлігіне бірігіп байланысады. Репрессордың қалған екі кішібірлігі бұл модельде ештеңе жасамайды, бірақ бұл қасиет көп жылдар бойы түсініксіз болды. Соңында лак регуляциясында тағы екі оператор қатысатыны анықталды. Бірі (O3) lacI генінің соңында O1-ден шамамен −90 б.ж. жоғары орналасқан, ал екіншісі (O2) lacZ генінің басында O1-ден шамамен +410 б.ж. төмен орналасқан. Бұл екі орын алғашқы жұмыстарда табылмай қалды, себебі олардың функциялары артық, ал жеке мутациялар репрессияға көп әсер етпейді. O2 немесе O3 операторларына жасалған жеке мутациялар 2-3 есе ғана әсер етеді. Дегенмен, олардың маңыздылығы O2 және O3 операторларында дефектісі бар қос мутанттың регрессиясы күрт төмендеуімен (шамамен 70 есе) дәлелденеді. Қазіргі модельде лак репрессоры бір мезгілде O1 негізгі операторына және O2 немесе O3 операторларының біреуіне байланысады. Арадағы ДНК кешеннен шығып тұрады. Екі қосымша оператордың артық болуы нақты циклдік кешеннің маңызды еместігін көрсетеді. Бір идея бойынша, жүйе байланыстыру арқылы жұмыс істейді; егер байланысқан репрессор O1-ден сәтке босаса, қосымша операторға байланысу оны жақын жерде ұстап тұрады, соның арқасында ол тез қайта байланыса алады. Бұл репрессордың O1-ге деген туыстығын арттырады.
The lac repressor is a four part protein, a tetramer, with identical subunits. Each subunit contains a helix turn helix (HTH) motif capable of binding to DNA. The operator site where repressor binds is a DNA sequence with inverted repeat symmetry. The two DNA half sites of the operator together bind to two of the subunits of the repressor. Although the other two subunits of repressor are not doing anything in this model, this property was not understood for many years. Eventually it was discovered that two additional operators are involved in lac regulation. One (O3) lies about −90 bp upstream of O1 in the end of the lacI gene, and the other (O2) is about +410 bp downstream of O1 in the early part of lacZ. These two sites were not found in the early work because they have redundant functions and individual mutations do not affect repression very much. Single mutations to either O2 or O3 have only 2 to 3 fold effects. However, their importance is demonstrated by the fact that a double mutant defective in both O2 and O3 is dramatically de repressed (by about 70 fold). In the current model, lac repressor is bound simultaneously to both the main operator O1 and to either O2 or O3. The intervening DNA loops out from the complex. The redundant nature of the two minor operators suggests that it is not a specific looped complex that is important. One idea is that the system works through tethering; if bound repressor releases from O1 momentarily, binding to a minor operator keeps it in the vicinity, so that it may rebind quickly. This would increase the affinity of repressor for O1.
Индукция механизмі
Репрессор – аллостериялық белок, яғни ол бір-бірімен тепе-теңдікте болатын екі сәл әртүрлі пішіннің біреуін қабылдай алады. Бір пішінде репрессор оператор ДНК-мен жоғары ерекшелікпен байланысады, ал екінші пішінде ол ерекшелігін жоғалтады. Индукцияның классикалық моделі бойынша, индуктордың – аллолактозаның немесе IPTG-нің – репрессорға байланысуы репрессордың екі пішін арасындағы таралуына әсер етеді. Осылайша, индуктормен байланысқан репрессор ДНК-мен байланыспайтын конформацияда тұрақтанады. Дегенмен, бұл қарапайым модель толық суретті көрсетпейді, себебі репрессор ДНК-ға жеткілікті тұрақты байланысса да, индуктор қосылғанда одан тез босап шығады. Сондықтан, индуктор репрессор ДНК-мен байланысқан кезде де, репрессормен байланыса алатыны анық көрінеді. Байланудың нақты механизмі әлі толыққанды анықталған жоқ.
The repressor is an allosteric protein, i. e. it can assume either one of two slightly different shapes, which are in equilibrium with each other. In one form the repressor will bind to the operator DNA with high specificity, and in the other form it has lost its specificity. According to the classical model of induction, binding of the inducer, either allolactose or IPTG, to the repressor affects the distribution of repressor between the two shapes. Thus, repressor with inducer bound is stabilized in the non DNA binding conformation. However, this simple model cannot be the whole story, because repressor is bound quite stably to DNA, yet it is released rapidly by addition of inducer. Therefore, it seems clear that an inducer can also bind to the repressor when the repressor is already bound to DNA. It is still not entirely known what the exact mechanism of binding is.
Белгісіз байланыстырудың рөлі
Репрессордың ДНК-мен ерекшеленбеген байланысы Лак оперонының басылуы мен индукциясында маңызды рөл атқарады. Лак репрессорлық ақуыздың ерекше байланысу орны оператор болып табылады. Ерекшеленбеген өзара әрекеттесу негізінен зарядтардың өзара әрекеттесуі арқылы жүзеге асады, ал операторға байланысу гидрофобтық өзара әрекеттесулермен нығайтылады. Сонымен қатар, репрессордың байланыса алатын ерекше емес ДНК тізбектерінің көптігі бар. Құндық тұрғысынан алғанда, оператор емес кез келген тізбек ерекше емес деп есептеледі. Зерттеулер көрсеткендей, ерекшеленбеген байланыс болмаған жағдайда, Лак оперонының индукциясы (немесе басылудан босатылуы) индуктордың қаныққан деңгейіне жеткеніне қарамастан жүрмейді. Ерекшеленбеген байланыссыз базалық индукция деңгейі қалыпты жағдайдан он мың есе төмен екені көрсетілді. Бұл себебі ерекше емес ДНК репрессорлық ақуыздарды сіңіріп алатын "құдық" сияқты әрекет етеді, оларды оператордан аударып алады. Ерекше емес тізбектер клеткадағы қол жетімді репрессор мөлшерін азайтады. Бұл өз кезегінде жүйені босату үшін қажетті индуктор мөлшерін азайтады.
Non specific binding of the repressor to DNA plays a crucial role in the repression and induction of the Lac operon. The specific binding site for the Lac repressor protein is the operator. The non specific interaction is mediated mainly by charge charge interactions while binding to the operator is reinforced by hydrophobic interactions. Additionally, there is an abundance of non specific DNA sequences to which the repressor can bind. Essentially, any sequence that is not the operator, is considered non specific. Studies have shown, that without the presence of non specific binding, induction (or unrepression) of the Lac operon could not occur even with saturated levels of inducer. It had been demonstrated that, without non specific binding, the basal level of induction is ten thousand times smaller than observed normally. This is because the non specific DNA acts as sort of a "sink" for the repressor proteins, distracting them from the operator. The non specific sequences decrease the amount of available repressor in the cell. This in turn reduces the amount of inducer required to unrepress the system.
Лактозаның аналогтары
Лактозаның лак оперонымен жұмыс істеуге пайдалы лактоза туындылары немесе аналогтары сипатталған. Бұл қосылыстар негізінен лактозаның глюкозалық бөлігі басқа химиялық топпен ауыстырылатын алмастырылған галактозидтер болып табылады. Изопропил β D тиогалактопиранозиді (IPTG) физиологиялық жұмыстарда лак оперонының индукторы ретінде жиі қолданылады. IPTG репрессормен байланысып, оны инактивациялайды, бірақ β-галактозидазаның субстраты емес. In vivo зерттеулер үшін IPTG-нің бір артықшылығы – ол E. coli бактериясымен метаболизмделмейді. Оның концентрациясы тұрақты болып қалады және лак оперонымен бақыланатын гендердің экспрессиясы экспериментте өзгермелі болмайды. IPTG қабылдауы P. fluorescens-те лактозаның әсеріне байланысты, бірақ E. coli-де емес. Фенил β D галактозасы (фенил Gal) β-галактозидазаның субстраты болып табылады, бірақ репрессорды инактивацияламайды, сондықтан индуктор емес. Жабайы типтегі жасушалар β-галактозидазаны өте аз өндіретіндіктен, олар көміртек және энергия көзі ретінде фенил Gal-мен өсе алмайды. Репрессорсыз мутанттар фенил Gal-мен өседі. Осылайша, көміртек және энергия көзі ретінде тек фенил Gal-ды қамтитын минималды орта репрессорлық мутанттар мен операторлық мутанттар үшін таңдамалы болып табылады. Егер фенил Gal-ды құрайтын агар пластиналарына 108 жасуша жабайы типтен орналастырылса, онда өсетін сирек колониялар репрессорға әсер ететін, негізінен, спонтанды түрде пайда болған мутанттар болады. Репрессорлық және операторлық мутанттардың салыстырмалы таралуы мақсатты өлшемге байланысты. ЛакI генін кодтайтын репрессор операторға қарағанда 50 есе үлкен болғандықтан, репрессорлық мутанттар іріктемеде басым болады. Тиометил галактозиді (TMG) лактозаның тағы бір аналогы болып табылады. Ол лак репрессорды тежейді. Индуктордың төмен концентрациясында TMG және IPTG екеуі де лактозалық пропилента арқылы жасушаға кіре алады. Алайда жоғары индукторлық концентрацияларда екі аналог та жасушаға өздігінен кіре алады. TMG жоғары жасушалық концентрацияларда өсу жылдамдығын төмендетуі мүмкін. Басқа қосылыстар β-галактозидаза белсенділігінің түрлі-түсті индикаторлары ретінде қызмет етеді. ONPG бөлінеді және орто-нитрофенол мен галактозадан тұратын жарық сары түсті қосылыс түзіледі, және ол β-галактозидазаның in vitro сынағы үшін жиі қолданылады. β-галактозидазаны өндіретін колониялар X gal (5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-галактозид) арқылы көк түске айналады, ол B-галактозидазаның жасанды субстраты болып табылады, оның бөлінуінен галактоза және 4-Cl,3-Br индиго пайда болады, осылайша терең көк түс пайда болады. Аллолактоза лактозаның изомері және лак оперонының индукторы болып табылады. Лактоза – галактоза β(1→4) глюкоза, ал аллолактоза – галактоза β(1→6) глюкоза. Лактоза β-галактозидаза арқылы аллолактозаға гидролиз реакциясына балама реакция арқылы айналады. Физиологиялық эксперимент LacZ-нің E. coli жасушаларында "нағыз" индукторды өндірудегі рөлін көрсетеді, яғни lacZ-нің нөлдік мутанты аллолактозаның гидролизделмейтін аналогы IPTG-мен өсірілгенде LacY пермеазасын өндіре алады, бірақ лактозамен өсірілгенде өндіре алмайды. Бұл процестің себебі лактозаны аллолактозаға (β-галактозидазамен катализденеді) айналдыру жасушаның ішінде индукторды өндіру үшін қажет.
A number of lactose derivatives or analogs have been described that are useful for work with the lac operon. These compounds are mainly substituted galactosides, where the glucose moiety of lactose is replaced by another chemical group. Isopropyl β D thiogalactopyranoside (IPTG) is frequently used as an inducer of the lac operon for physiological work. IPTG binds to repressor and inactivates it, but is not a substrate for β galactosidase. One advantage of IPTG for in vivo studies is that since it cannot be metabolized by E. coli. Its concentration remains constant and the rate of expression of lac p/o controlled genes is not a variable in the experiment. IPTG intake is dependent on the action of lactose permease in P. fluorescens, but not in E. coli. Phenyl β D galactose (phenyl Gal) is a substrate for β galactosidase, but does not inactivate repressor and so is not an inducer. Since wild type cells produce very little β galactosidase, they cannot grow on phenyl Gal as a carbon and energy source. Mutants lacking repressor are able to grow on phenyl Gal. Thus, minimal medium containing only phenyl Gal as a source of carbon and energy is selective for repressor mutants and operator mutants. If 108 cells of a wild type strain are plated on agar plates containing phenyl Gal, the rare colonies which grow are mainly spontaneous mutants affecting the repressor. The relative distribution of repressor and operator mutants is affected by the target size. Since the lacI gene encoding repressor is about 50 times larger than the operator, repressor mutants predominate in the selection. Thiomethyl galactoside [TMG] is another lactose analog. These inhibit the lacI repressor. At low inducer concentrations, both TMG and IPTG can enter the cell through the lactose permease. However at high inducer concentrations, both analogs can enter the cell independently. TMG can reduce growth rates at high extracellular concentrations. Other compounds serve as colorful indicators of β galactosidase activity. ONPG is cleaved to produce the intensely yellow compound, orthonitrophenol and galactose, and is commonly used as a substrate for assay of β galactosidase in vitro. Colonies that produce β galactosidase are turned blue by X gal (5 bromo 4 chloro 3 indolyl β D galactoside) which is an artificial substrate for B galactosidase whose cleavage results in galactose and 4 Cl,3 Br indigo thus producing a deep blue color. Allolactose is an isomer of lactose and is the inducer of the lac operon. Lactose is galactose β(1→4) glucose, whereas allolactose is galactose β(1→6) glucose. Lactose is converted to allolactose by β galactosidase in an alternative reaction to the hydrolytic one. A physiological experiment which demonstrates the role of LacZ in production of the "true" inducer in E. coli cells is the observation that a null mutant of lacZ can still produce LacY permease when grown with IPTG, a non hydrolyzable analog of allolactose, but not when grown with lactose. The explanation is that processing of lactose to allolactose (catalyzed by β galactosidase) is needed to produce the inducer inside the cell.
Классикалық моделінің дамуы
Франсуа Якоб пен Жак Монод қолданған эксперименталды микроорганизм – жалпы зертханалық бактерия, E. coli, бірақ Якоб пен Монод ашқан көптеген негізгі реттеуші ұғымдар барлық организмдердегі жасушалық реттеудің негізі болып табылады. Басты идея – қажет болмаған кезде ақуыздар синтезделмейді. E. coli, лактозаны метаболиздейтін қажеттілік болмағанда, мысалы, глюкоза сияқты басқа қанттар бар болғанда, үш Lac протеинін жасамай, жасушалық ресурстар мен энергияны сақтайды. Келесі бөлімде E. coli бактериясының метаболиздік қажеттіліктерге жауап ретінде белгілі бір гендерді қалай басқаратыны талқыланады. Екінші дүниежүзілік соғыс кезінде Монод қанттардың әртүрлі комбинацияларын E. coli және B. subtilis үшін қоректік заттар ретінде сынады. Монод бактериялар мен ашытқылар бойынша басқа ғалымдар жүргізген ұқсас зерттеулерді жалғастырды. Ол екі түрлі қантпен өсірілген бактериялардың көбінесе екі фазада өсетінін анықтады. Мысалы, глюкоза мен лактоза екеуі де берілген жағдайда, алдымен глюкоза (1-кезең, 2-суретті қараңыз), содан кейін лактоза (2-кезең) метаболизденді. Ортада глюкоза мен лактозаның екеуі де болған кезде β-галактозидаза жасалмағандықтан, лактоза диауксиялық өсу қисығының бірінші бөлігінде метаболизденбеді. Монод осы құбылысты диаукси деп атады. Содан кейін Монод назарын лактоза ғана өсіру ортасында болған кезде болатын β-галактозидазаның индукциясына шоғырлады.
The experimental microorganism used by François Jacob and Jacques Monod was the common laboratory bacterium, E. coli, but many of the basic regulatory concepts that were discovered by Jacob and Monod are fundamental to cellular regulation in all organisms. The key idea is that proteins are not synthesized when they are not needed—E. coli conserves cellular resources and energy by not making the three Lac proteins when there is no need to metabolize lactose, such as when other sugars like glucose are available. The following section discusses how E. coli controls certain genes in response to metabolic needs. During World War II, Monod was testing the effects of combinations of sugars as nutrient sources for E. coli and B. subtilis. Monod was following up on similar studies that had been conducted by other scientists with bacteria and yeast. He found that bacteria grown with two different sugars often displayed two phases of growth. For example, if glucose and lactose were both provided, glucose was metabolized first (growth phase I, see Figure 2) and then lactose (growth phase II). Lactose was not metabolized during the first part of the diauxic growth curve because β galactosidase was not made when both glucose and lactose were present in the medium. Monod named this phenomenon diauxie. Monod then focused his attention on the induction of β galactosidase formation that occurred when lactose was the sole sugar in the culture medium.
Регулятивтік мутанттардың жіктелуі
Якоб пен Монодтың тұжырымдамалық табысы – реттеуші заттар мен ген экспрессиясын өзгертуге әсер ететін орындар арасындағы айырмашылықты анықтау болды. Әскерде болған Якоб, арнайы радиохабар немесе сигнал алғаннан кейін залал келтіретін жүгін босататын бомбалаушы ұшақтың мысалын келтірді. Жұмыс істейтін жүйеге жердегі хабар таратушы және ұшақтағы қабылдағыш қажет. Егер әдеттегі хабар таратушы бұзылса, оны екінші, жұмыс істейтін хабар таратушыны қосу арқылы жөндеуге болады. Оның айтуынша, радиоқабылдағышы бұзылған бомбалаушы ұшақты қарастырайық. Мұндай ұшақтың мінез-құлқын екінші, жұмыс істейтін ұшақпен өзгерту мүмкін емес. Lac оператордың реттеуші мутанттарын зерттеу үшін Якоб лак гендерінің екінші көшірмесін (lacI промоторымен, ал lacZYA промоторымен және операторымен) бір жасушаға енгізуге болатын жүйені жасады. Мұндай бактериялардың өсіндісі, лак гендері үшін диплоидты, бірақ басқа жағынан қалыпты, реттеуші фенотип үшін тексеріледі. Атап айтқанда, LacZ және LacY IPTG болмағанда да (мутант геннің лактоза репрессоры жұмыс істемейтіндіктен) түзіледі ме, жоқ па, анықталады. Гендер немесе гендер кластерлері жұптармен тексерілетін бұл тәжірибе комплементация тесті деп аталады. Бұл тест суретте көрсетілген (қарпайылылық үшін lacA алынып тасталған). Біріншіден, белгілі бір гаплоидтық күйлер көрсетілген (яғни жасуша лак гендерінің тек бір көшірмесін алып жүреді). (a) панелі репрессияны, (b) IPTG индукциясын, ал (c) және (d) lacI геніндегі немесе оператордағы мутацияның әсерін көрсетеді. (e) панелінде репрессорға арналған комплементация тесті көрсетілген. Егер лак гендерінің бір көшірмесі lacI-де мутацияны алып жүрсе, ал екінші көшірме lacI-нің жабайы түрі болса, алынған фенотип қалыпты болады, бірақ LacZ индуктор IPTG әсеріне ұшырағанда экспрессияланады. Репрессорға әсер ететін мутациялар жабайы типке рецессивті (жабайы тип басым) деп есептеледі, себебі репрессор – жасушада диффузияға қабілетті кішкентай белок. LacI генінің жанында орналасқан Lac оператордың көшірмесі екінші көшірмеден алынған белоктың әсерінен тиімді түрде өшіріледі. Егер дәл осы тәжірибе оператор мутациясын қолдану арқылы жүргізілсе, басқа нәтиже алынады (f панелі). Бір мутантты және бір жабайы типтегі операторлық сайтты алып жүретін жасушаның фенотипі – LacZ және LacY IPTG болмағанда да түзіледі; себебі зақымдалған операторлық сайт репрессордың құрылымдық гендердің транскрипциясын тежеуіне мүмкіндік бермейді. Оператор мутациясы басым. Репрессор байлануы тиіс операторлық сайт мутациямен зақымдалғанда, сол жасушадағы екінші функционалдық сайттың болуы мутантты сайттың бақылауындағы гендердің экспрессиясына ешқандай әсер етпейді. Бұл тәжірибенің күрделірек нұсқасы лак гендерінің екі көшірмесін ажырату үшін таңбаланған операторларды қолданады және реттелмеген құрылымдық ген(дер) мутант оператордың жанында орналасқан(дары) екенін көрсетеді (g панелі). Мысалы, бір көшірмеде LacZ белсенділігін жоғалтатын мутация болса, ол тек LacY белгісін ғана шығара алады, ал екінші көшірмеде lacY-ге әсер ететін мутация болса, ол тек LacZ-ді шығара алады. Бұл нұсқада IPTG болмағанда тек мутант оператормен іргелес орналасқан Lac оператордың көшірмесі ғана экспрессияланады. Оператор мутациясы цис-доминантты, ол жабайы типке доминантты, бірақ оператордың тек оған жақын орналасқан көшірмесіне ғана әсер етеді. Бұл түсіндірме маңызды жағынан қате, себебі ол тәжірибенің сипаттамасынан басталады, содан кейін нәтижелерді модель тұрғысынан түсіндіреді. Бірақ шындығында, көбінесе модель бірінші болады, ал тәжірибе осы модельді тексеру үшін жасалады. Якоб пен Монод алдымен ДНК-да оператордың қасиеттері бар орын болуы керек деп ойлады, содан кейін осыны көрсету үшін олардың комплементациялық сынақтарын жасады. Оператор мутанттарының басымдығы оларды арнайы іріктеу процедурасын ұсынады. Егер жоғарыда сипатталғандай фенил гал қолдана отырып, жабайы типтегі дақылдан реттеуші мутанттарды таңдап алса, операторлық мутация репрессорлық мутациялармен салыстырғанда сирек кездеседі, себебі мақсатты өлшемі өте кішкентай. Бірақ егер біз бүкіл лак аймағының екі көшірмесін (лак үшін диплоидты) алып жүретін штаммнан бастасақ, репрессорлық мутациялар (бұл әлі де кездеседі) қалпына келтірілмейді, себебі екінші, жабайы типтегі lacI генімен комплементация жабайы типтегі фенотипті қамтамасыз етеді. Керісінше, оператордың бір көшірмесінің мутациясы мутант фенотипті қамтамасыз етеді, себебі ол екінші, жабайы типтегі көшірмеге доминантты.
A conceptual breakthrough of Jacob and Monod was to recognize the distinction between regulatory substances and sites where they act to change gene expression. A former soldier, Jacob used the analogy of a bomber that would release its lethal cargo upon receipt of a special radio transmission or signal. A working system requires both a ground transmitter and a receiver in the airplane. Now, suppose that the usual transmitter is broken. This system can be made to work by introduction of a second, functional transmitter. In contrast, he said, consider a bomber with a defective receiver. The behavior of this bomber cannot be changed by introduction of a second, functional aeroplane. To analyze regulatory mutants of the lac operon, Jacob developed a system by which a second copy of the lac genes (lacI with its promoter, and lacZYA with promoter and operator) could be introduced into a single cell. A culture of such bacteria, which are diploid for the lac genes but otherwise normal, is then tested for the regulatory phenotype. In particular, it is determined whether LacZ and LacY are made even in the absence of IPTG (due to the lactose repressor produced by the mutant gene being non functional). This experiment, in which genes or gene clusters are tested pairwise, is called a complementation test. This test is illustrated in the figure (lacA is omitted for simplicity). First, certain haploid states are shown (i. e. the cell carries only a single copy of the lac genes). Panel (a) shows repression, (b) shows induction by IPTG, and (c) and (d) show the effect of a mutation to the lacI gene or to the operator, respectively. In panel (e) the complementation test for repressor is shown. If one copy of the lac genes carries a mutation in lacI, but the second copy is wild type for lacI, the resulting phenotype is normal—but lacZ is expressed when exposed to inducer IPTG. Mutations affecting repressor are said to be recessive to wild type (and that wild type is dominant), and this is explained by the fact that repressor is a small protein which can diffuse in the cell. The copy of the lac operon adjacent to the defective lacI gene is effectively shut off by protein produced from the second copy of lacI. If the same experiment is carried out using an operator mutation, a different result is obtained (panel (f)). The phenotype of a cell carrying one mutant and one wild type operator site is that LacZ and LacY are produced even in the absence of the inducer IPTG; because the damaged operator site, does not permit binding of the repressor to inhibit transcription of the structural genes. The operator mutation is dominant. When the operator site where repressor must bind is damaged by mutation, the presence of a second functional site in the same cell makes no difference to expression of genes controlled by the mutant site. A more sophisticated version of this experiment uses marked operons to distinguish between the two copies of the lac genes and show that the unregulated structural gene(s) is(are) the one(s) next to the mutant operator (panel (g). For example, suppose that one copy is marked by a mutation inactivating lacZ so that it can only produce the LacY protein, while the second copy carries a mutation affecting lacY and can only produce LacZ. In this version, only the copy of the lac operon that is adjacent to the mutant operator is expressed without IPTG. We say that the operator mutation is cis dominant, it is dominant to wild type but affects only the copy of the operon which is immediately adjacent to it. This explanation is misleading in an important sense, because it proceeds from a description of the experiment and then explains the results in terms of a model. But in fact, it is often true that the model comes first, and an experiment is fashioned specifically to test the model. Jacob and Monod first imagined that there must be a site in DNA with the properties of the operator, and then designed their complementation tests to show this. The dominance of operator mutants also suggests a procedure to select them specifically. If regulatory mutants are selected from a culture of wild type using phenyl Gal, as described above, operator mutations are rare compared to repressor mutants because the target size is so small. But if instead we start with a strain which carries two copies of the whole lac region (that is diploid for lac), the repressor mutations (which still occur) are not recovered because complementation by the second, wild type lacI gene confers a wild type phenotype. In contrast, mutation of one copy of the operator confers a mutant phenotype because it is dominant to the second, wild type copy.
Молекулалық биологияда қолдану
Лак гені және оның туындыларын бактериялық негіздегі таңдау әдістерінің бірнешесінде, мысалы, екі гибридті талдауда репортерлік ген ретінде қолдануға болады, онда транскрипциялық активатордың белгілі бір промотор тізбегіне сәтті байланысуы анықталуы тиіс.
The lac gene and its derivatives are amenable to use as a reporter gene in a number of bacterial based selection techniques such as two hybrid analysis, in which the successful binding of a transcriptional activator to a specific promoter sequence must be determined.