Лактозный оперон: регуляция метаболизма лактозы у бактерий.

Введение

Гены, кодирующие белки и ферменты для метаболизма лактозы. Оперон лактозы (лаковый оперон) – это оперон, необходимый для транспорта и метаболизма лактозы в *E. coli* и многих других энтеробактериях. Хотя глюкоза является предпочтительным источником углерода для большинства энтеробактерий, лаковый оперон обеспечивает эффективное переваривание лактозы при отсутствии глюкозы благодаря активности β-галактозидазы. Регуляция генов лакового оперона была первым четко понятым генетическим регуляторным механизмом, поэтому он стал основным примером регуляции генов у прокариот. По этой причине он часто обсуждается на вводных занятиях по молекулярной и клеточной биологии. Франсуа Жакоб и Жак Моно использовали эту систему метаболизма лактозы, чтобы определить, как биологическая клетка понимает, какой фермент синтезировать. Их работа над лаковым опероном принесла им Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1965 году. В отсутствие лактозы лактозный репрессор, кодируемый *lacI*, останавливает синтез ферментов и транспортных белков, кодируемых лаковым опероном, блокируя ДНК-зависимую РНК-полимеразу. Это блокирование/остановка не является абсолютным, и минимальный уровень экспрессии генов происходит постоянно. Репрессорный белок всегда экспрессируется, но лаковый оперон (ферменты и транспортные белки) находится в состоянии репрессии (но не полной остановки).

Set genes encoding proteins and enzymes for lactose metabolism

The lactose operon (lac operon) is an operon required for the transport and metabolism of lactose in E. coli and many other enteric bacteria. Although glucose is the preferred carbon source for most enteric bacteria, the lac operon allows for the effective digestion of lactose when glucose is not available through the activity of beta galactosidase. Gene regulation of the lac operon was the first genetic regulatory mechanism to be understood clearly, so it has become a foremost example of prokaryotic gene regulation. It is often discussed in introductory molecular and cellular biology classes for this reason. This lactose metabolism system was used by François Jacob and Jacques Monod to determine how a biological cell knows which enzyme to synthesize. Their work on the lac operon won them the Nobel Prize in Physiology in 1965. In the absence of lactose, the lac repressor, encoded by lacI, halts production of the enzymes and transport proteins encoded by the lac operon. It does so by blocking the DNA dependent RNA polymerase. This blocking/ halting is not perfect, and a minimal amount of gene expression does take place all the time. The repressor protein is always expressed, but the lac operon (enzymes and transport proteins) are repressed. (But not completely stopped)

When lactose is available but not glucose, then some lactose enters the cell using pre existing transport protein encoded by lacY. This lactose then combines with the repressor and inactivates it, hence allowing the lac operon to be expressed. Then more β galactoside permease is synthesized allowing even more lactose to enter and the enzymes encoded by lacZ and lacA can digest it. However, In the presence of glucose, regardless of the presence of lactose, the operon will be repressed. This is because the catabolite activator protein (CAP), required for production of the enzymes, remains inactive, and EIIAGlc shuts down lactose permease to prevent transport of lactose into the cell. This dual control mechanism causes the sequential utilization of glucose and lactose in two distinct growth phases, known as diauxie.

При наличии лактозы, но отсутствии глюкозы, некоторая часть лактозы проникает в клетку с помощью уже существующего транспортного белка, кодируемого *lacY*. Эта лактоза связывается с репрессором и инактивирует его, что позволяет экспрессировать лаковый оперон. Затем синтезируется больше β-галактозидной пермеазы, что обеспечивает поступление еще большего количества лактозы, и ферменты, кодируемые *lacZ* и *lacA*, могут ее расщеплять. Однако, в присутствии глюкозы, независимо от наличия лактозы, оперон будет подавлен. Это происходит потому, что активаторный белок, чувствительный к камполитным соединениям (CAP), необходимый для синтеза ферментов, остается неактивным, а EIIAGlc блокирует лактозную пермеазу, предотвращая транспорт лактозы в клетку. Этот двойной механизм контроля приводит к последовательному использованию глюкозы и лактозы в двух различных фазах роста, известном как диауксия.

Структура

Лак-оперон состоит из 3 структурных генов, промотора, терминатора, регулятора и оператора. Три структурных гена: lacZ, lacY и lacA. lacZ кодирует β-галактозидазу (LacZ), внутриклеточный фермент, который расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. lacY кодирует бета-галактозидную пермеазу (LacY), трансмембранный симпортер, переносящий в клетку β-галактозиды, включая лактозу, с использованием градиента протонов в том же направлении. Пермеаза повышает проницаемость клетки для β-галактозидов. lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу (LacA), фермент, который переносит ацетильную группу из ацетил-CoA на тиогалактозид. Для катаболического пути лактозы необходимы только lacZ и lacY.

Регулирование

Конкретный контроль генов лактозы зависит от доступности субстрата лактозы для бактерии. Белки не производятся бактерией, когда лактоза недоступна в качестве источника углерода. Лак-гены организованы в оперон, то есть они ориентированы в одном направлении непосредственно рядом на хромосоме и ко-транскрибируются в одну полицистроническую молекулу мРНК. Транскрипция всех генов начинается с связывания фермента РНК-полимеразы (РНКП), белка, связывающего ДНК, который связывается с определенным участком связывания ДНК, промотором, непосредственно выше по течению генов. Связывание РНК-полимеразы с промотором облегчается белком катаболита-активатором, связанным с цАМФ (CAP, также известным как белок рецептора цАМФ). Однако ген *lacI* (ген-регулятор лакопера) производит белок, который блокирует связывание РНКП с оператором оперона. Этот белок может быть удален только при связывании с ним аллолактозы, что приводит к его инактивации. Белок, образуемый геном *lacI*, известен как репрессор *lac*. Тип регуляции, которой подвергается лакоперон, называется отрицательно индуцируемой, что означает, что ген выключен регуляторным фактором (репрессором *lac*), пока не будет добавлена определенная молекула (лактоза). После удаления репрессора РНКП приступает к транскрипции всех трех генов (*lacZYA*) в мРНК. Каждый из трех генов на нити мРНК имеет свою собственную последовательность Шайна-Дальгарно, поэтому гены транслируются независимо друг от друга. Последовательности ДНК лакоперана *E. coli*, мРНК *lacZYA* и гены *lacI* доступны в GenBank (просмотр). Первый механизм контроля – это регуляторный ответ на лактозу, который использует внутриклеточный регуляторный белок, называемый репрессором лактозы, для подавления выработки β-галактозидазы в отсутствие лактозы. Ген *lacI*, кодирующий репрессор, расположен рядом с лакопероном и постоянно экспрессируется (конститутивно). Если лактоза отсутствует в среде для роста, репрессор очень плотно связывается с короткой последовательностью ДНК, расположенной ниже по течению от промотора, вблизи начала *lacZ*, называемой оператором *lac*. Связывание репрессора с оператором препятствует связыванию РНКП с промотором, и поэтому мРНК, кодирующая LacZ и LacY, образуется только на очень низких уровнях. Однако, когда клетки выращиваются в присутствии лактозы, метаболит лактозы, называемый аллолактозой, образующийся из лактозы продуктом гена *lacZ*, связывается с репрессором, вызывая аллостерический сдвиг. В таком измененном состоянии репрессор не может связываться с оператором, что позволяет РНКП транскрибировать гены лака и, таким образом, приводит к повышению уровня кодируемых белков. Второй механизм контроля – это ответ на глюкозу, который использует гомодимер белка катаболита-активатора (CAP) для значительного увеличения выработки β-галактозидазы в отсутствие глюкозы. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является сигнальной молекулой, концентрация которой обратно пропорциональна концентрации глюкозы. Он связывается с CAP, что, в свою очередь, позволяет CAP связываться с участком связывания CAP (последовательность ДНК из 16 нуклеотидов, расположенная выше по течению от промотора слева на диаграмме ниже, примерно в 60 нуклеотидах выше по течению от места начала транскрипции), что способствует связыванию РНКП с ДНК. В отсутствие глюкозы концентрация цАМФ высока, и связывание CAP-цАМФ с ДНК значительно увеличивает выработку β-галактозидазы, что позволяет клетке гидролизовать лактозу и высвобождать галактозу и глюкозу. Недавно было показано, что исключение индуктора блокирует экспрессию лакоперана при наличии глюкозы. Глюкоза транспортируется в клетку посредством зависимой от ФЕФ системы фосфотрансферазы. Фосфоенолпируват переносится через каскад фосфорилирования, состоящий из общих белков ФТС (фосфотрансферазной системы) HPr и EIA и специфичных для глюкозы белков ФТС EIIAGlc и EIIBGlc, цитоплазматического домена транспортера глюкозы EII. Транспорт глюкозы сопровождается ее фосфорилированием EIIBGlc, что приводит к удалению фосфатной группы из других белков ФТС, включая EIIAGlc. Нефосфорилированная форма EIIAGlc связывается с лак-пермеазой и препятствует ее переносу лактозы в клетку. Поэтому, если присутствуют как глюкоза, так и лактоза, транспорт глюкозы блокирует транспорт индуктора лакоперана.

Specific control of the lac genes depends on the availability of the substrate lactose to the bacterium. The proteins are not produced by the bacterium when lactose is unavailable as a carbon source. The lac genes are organized into an operon; that is, they are oriented in the same direction immediately adjacent on the chromosome and are co transcribed into a single polycistronic mRNA molecule. Transcription of all genes starts with the binding of the enzyme RNA polymerase (RNAP), a DNA binding protein, which binds to a specific DNA binding site, the promoter, immediately upstream of the genes. Binding of RNA polymerase to the promoter is aided by the cAMP bound catabolite activator protein (CAP, also known as the cAMP receptor protein). However, the lacI gene (regulatory gene for lac operon) produces a protein that blocks RNAP from binding to the operator of the operon. This protein can only be removed when allolactose binds to it, and inactivates it. The protein that is formed by the lacI gene is known as the lac repressor. The type of regulation that the lac operon undergoes is referred to as negative inducible, meaning that the gene is turned off by the regulatory factor (lac repressor) unless some molecule (lactose) is added. Once the repressor is removed, RNAP then proceeds to transcribe all three genes (lacZYA) into mRNA. Each of the three genes on the mRNA strand has its own Shine Dalgarno sequence, so the genes are independently translated. The DNA sequence of the E. coli lac operon, the lacZYA mRNA, and the lacI genes are available from GenBank (view). The first control mechanism is the regulatory response to lactose, which uses an intracellular regulatory protein called the lactose repressor to hinder production of β galactosidase in the absence of lactose. The lacI gene coding for the repressor lies nearby the lac operon and is always expressed (constitutive). If lactose is missing from the growth medium, the repressor binds very tightly to a short DNA sequence just downstream of the promoter near the beginning of lacZ called the lac operator. The repressor binding to the operator interferes with binding of RNAP to the promoter, and therefore mRNA encoding LacZ and LacY is only made at very low levels. When cells are grown in the presence of lactose, however, a lactose metabolite called allolactose, made from lactose by the product of the lacZ gene, binds to the repressor, causing an allosteric shift. Thus altered, the repressor is unable to bind to the operator, allowing RNAP to transcribe the lac genes and thereby leading to higher levels of the encoded proteins. The second control mechanism is a response to glucose, which uses the catabolite activator protein (CAP) homodimer to greatly increase production of β galactosidase in the absence of glucose. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a signal molecule whose prevalence is inversely proportional to that of glucose. It binds to the CAP, which in turn allows the CAP to bind to the CAP binding site (a 16 bp DNA sequence upstream of the promoter on the left in the diagram below, about 60 bp upstream of the transcription start site), which assists the RNAP in binding to the DNA. In the absence of glucose, the cAMP concentration is high and binding of CAP cAMP to the DNA significantly increases the production of β galactosidase, enabling the cell to hydrolyse lactose and release galactose and glucose. More recently inducer exclusion was shown to block expression of the lac operon when glucose is present. Glucose is transported into the cell by the PEP dependent phosphotransferase system. The phosphate group of phosphoenolpyruvate is transferred via a phosphorylation cascade consisting of the general PTS (phosphotransferase system) proteins HPr and EIA and the glucose specific PTS proteins EIIAGlc and EIIBGlc, the cytoplasmic domain of the EII glucose transporter. Transport of glucose is accompanied by its phosphorylation by EIIBGlc, draining the phosphate group from the other PTS proteins, including EIIAGlc. The unphosphorylated form of EIIAGlc binds to the lac permease and prevents it from bringing lactose into the cell. Therefore, if both glucose and lactose are present, the transport of glucose blocks the transport of the inducer of the lac operon.

Структура подавляющего устройства

Лаковый репрессор представляет собой четырехкомпонентный белок, тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц. Каждая субъединица содержит мотив «спираль-поворот-спираль» (HTH), способный связываться с ДНК. Операторный участок, с которым связывается репрессор, представляет собой последовательность ДНК с инвертированной повторной симметрией. Два полусайта ДНК оператора вместе связываются с двумя субъединицами репрессора. Хотя другие две субъединицы репрессора, согласно этой модели, не выполняют никакой функции, это свойство долгое время оставалось непонятным. В конечном итоге было обнаружено, что в регуляции лака участвуют два дополнительных оператора. Один (O3) расположен примерно в −90 п.н. выше по течению от O1 в конце гена *lacI*, а другой (O2) – примерно в +410 п.н. ниже по течению от O1 в начале гена *lacZ*. Эти два участка не были обнаружены в ранних исследованиях, поскольку они обладают избыточными функциями, и отдельные мутации лишь незначительно влияют на репрессию. Одиночные мутации в O2 или O3 приводят лишь к 2–3-кратному эффекту. Однако их важность демонстрируется тем фактом, что двойной мутант, дефектный в обоих операторах O2 и O3, резко дерепрессируется (примерно в 70 раз). Согласно современной модели, лаковый репрессор одновременно связывается как с основным оператором O1, так и с O2 или O3. Промежуточная ДНК образует петлю, выходящую из комплекса. Избыточный характер двух дополнительных операторов позволяет предположить, что важен не конкретный петлевой комплекс. Одна из гипотез заключается в том, что система работает за счет якорения: если связанный репрессор на мгновение отсоединяется от O1, связывание с дополнительным оператором удерживает его вблизи, что позволяет ему быстро повторно связываться. Это повышает аффинность репрессора к O1.

Механизм индукции

Репрессор является аллостерическим белком, то есть он может принимать одну из двух слегка различающихся конформаций, находящихся в равновесии друг с другом. В одной из этих конформаций репрессор связывается с ДНК оператора с высокой специфичностью, а в другой – теряет эту специфичность. Согласно классической модели индукции, связывание индуктора – аллолактозы или IPTG – с репрессором влияет на соотношение между двумя конформациями репрессора. Таким образом, репрессор, связанный с индуктором, стабилизируется в конформации, не способной связываться с ДНК. Однако эта упрощенная модель не может полностью объяснить наблюдаемые явления, поскольку репрессор достаточно стабильно связывается с ДНК, но при добавлении индуктора быстро высвобождается. Следовательно, представляется очевидным, что индуктор может связываться с репрессором и тогда, когда репрессор уже связан с ДНК. Точный механизм этого связывания до сих пор полностью не выяснен.

Роль неспецифического связывания

Неспецифическое связывание репрессора с ДНК играет решающую роль в репрессии и индукции оперона Lac. Специфическим местом связывания для белка репрессора Lac является оператор. Неспецифическое взаимодействие опосредовано главным образом электростатическими взаимодействиями, в то время как связывание с оператором усиливается гидрофобными взаимодействиями. Кроме того, существует большое количество неспецифических последовательностей ДНК, к которым может связываться репрессор. По сути, любая последовательность, отличная от оператора, считается неспецифической. Исследования показали, что без неспецифического связывания индукция (или дерепрессия) оперона Lac не может произойти даже при насыщающих концентрациях индуктора. Было продемонстрировано, что без неспецифического связывания базовый уровень индукции в десять тысяч раз ниже, чем обычно наблюдается. Это связано с тем, что неспецифическая ДНК действует как своего рода "резервуар" для репрессорных белков, отвлекая их от оператора. Неспецифические последовательности уменьшают количество доступного репрессора в клетке. Это, в свою очередь, снижает количество индуктора, необходимого для дерепрессии системы.

Аналоги лактозы

Было описано несколько производных или аналогов лактозы, полезных для работы с лак-опероном. Эти соединения в основном представляют собой замещенные галактозиды, в которых глюкозный фрагмент лактозы заменен другой химической группой. Изопропил β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) часто используется в качестве индуктора лак-оперона в физиологических исследованиях. IPTG связывается с репрессором и инактивирует его, но не является субстратом для β-галактозидазы. Одним из преимуществ IPTG для исследований in vivo является то, что он не метаболизируется E. coli, поэтому его концентрация остается постоянной, а скорость экспрессии генов, контролируемых лак-п/о, не является переменной в эксперименте. Поглощение IPTG зависит от действия лактозопермеазы в P. fluorescens, но не в E. coli. Фенил β-D-галактоза (фенил Gal) является субстратом для β-галактозидазы, но не инактивирует репрессор и, следовательно, не является индуктором. Поскольку клетки дикого типа производят очень мало β-галактозидазы, они не могут расти на фенил-Gal в качестве источника углерода и энергии. Мутанты, лишенные репрессора, способны расти на фенил-Gal. Таким образом, минимальная среда, содержащая только фенил-Gal в качестве источника углерода и энергии, селективна для мутантов по репрессору и мутантов по оператору. Если 10⁸ клеток дикого типа штамма высеять на агаровые пластины, содержащие фенил-Gal, то редкие растущие колонии в основном представляют собой спонтанные мутанты, затрагивающие репрессор. Относительное распределение мутаций в репрессоре и операторе зависит от размера мишени. Поскольку ген lacI, кодирующий репрессор, примерно в 50 раз больше оператора, в селекции преобладают мутанты по репрессору. Тиометилгалактозид [TMG] – еще один аналог лактозы, который ингибирует лак-репрессор. При низких концентрациях индуктора как TMG, так и IPTG могут проникать в клетку через лактозную пермеазу. Однако при высоких концентрациях индуктора оба аналога могут проникать в клетку независимо друг от друга. TMG может снижать скорость роста при высоких внеклеточных концентрациях. Другие соединения служат яркими индикаторами активности β-галактозидазы. ONPG расщепляется с образованием интенсивно-желтого соединения, орто-нитрофенола и галактозы, и обычно используется в качестве субстрата для определения активности β-галактозидазы in vitro. Колонии, продуцирующие β-галактозидазу, окрашиваются в синий цвет X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактозид), который является искусственным субстратом для β-галактозидазы, расщепление которого приводит к образованию галактозы и 4-Cl,3-Br-индиго, что придает глубокий синий цвет. Аллолактоза является изомером лактозы и является индуктором лак-оперона. Лактоза – это галактоза β(1→4)глюкоза, в то время как аллолактоза – это галактоза β(1→6)глюкоза. Лактоза превращается в аллолактозу β-галактозидазой в альтернативной реакции по отношению к гидролитической. Физиологический эксперимент, демонстрирующий роль LacZ в производстве "истинного" индуктора в клетках E. coli, заключается в наблюдении, что нуль-мутант lacZ все еще может продуцировать LacY-пермеазу при выращивании с IPTG, негидролизуемым аналогом аллолактозы, но не при выращивании с лактозой. Объяснение заключается в том, что для образования индуктора внутри клетки необходима переработка лактозы в аллолактозу (катализируемая β-галактозидазой).

A number of lactose derivatives or analogs have been described that are useful for work with the lac operon. These compounds are mainly substituted galactosides, where the glucose moiety of lactose is replaced by another chemical group. Isopropyl β D thiogalactopyranoside (IPTG) is frequently used as an inducer of the lac operon for physiological work. IPTG binds to repressor and inactivates it, but is not a substrate for β galactosidase. One advantage of IPTG for in vivo studies is that since it cannot be metabolized by E. coli. Its concentration remains constant and the rate of expression of lac p/o controlled genes is not a variable in the experiment. IPTG intake is dependent on the action of lactose permease in P. fluorescens, but not in E. coli. Phenyl β D galactose (phenyl Gal) is a substrate for β galactosidase, but does not inactivate repressor and so is not an inducer. Since wild type cells produce very little β galactosidase, they cannot grow on phenyl Gal as a carbon and energy source. Mutants lacking repressor are able to grow on phenyl Gal. Thus, minimal medium containing only phenyl Gal as a source of carbon and energy is selective for repressor mutants and operator mutants. If 108 cells of a wild type strain are plated on agar plates containing phenyl Gal, the rare colonies which grow are mainly spontaneous mutants affecting the repressor. The relative distribution of repressor and operator mutants is affected by the target size. Since the lacI gene encoding repressor is about 50 times larger than the operator, repressor mutants predominate in the selection. Thiomethyl galactoside [TMG] is another lactose analog. These inhibit the lacI repressor. At low inducer concentrations, both TMG and IPTG can enter the cell through the lactose permease. However at high inducer concentrations, both analogs can enter the cell independently. TMG can reduce growth rates at high extracellular concentrations. Other compounds serve as colorful indicators of β galactosidase activity. ONPG is cleaved to produce the intensely yellow compound, orthonitrophenol and galactose, and is commonly used as a substrate for assay of β galactosidase in vitro. Colonies that produce β galactosidase are turned blue by X gal (5 bromo 4 chloro 3 indolyl β D galactoside) which is an artificial substrate for B galactosidase whose cleavage results in galactose and 4 Cl,3 Br indigo thus producing a deep blue color. Allolactose is an isomer of lactose and is the inducer of the lac operon. Lactose is galactose β(1→4) glucose, whereas allolactose is galactose β(1→6) glucose. Lactose is converted to allolactose by β galactosidase in an alternative reaction to the hydrolytic one. A physiological experiment which demonstrates the role of LacZ in production of the "true" inducer in E. coli cells is the observation that a null mutant of lacZ can still produce LacY permease when grown with IPTG, a non hydrolyzable analog of allolactose, but not when grown with lactose. The explanation is that processing of lactose to allolactose (catalyzed by β galactosidase) is needed to produce the inducer inside the cell.

Развитие классической модели

Экспериментальным микроорганизмом, использованным Франсуа Якобом и Жаком Монодом, была обычная лабораторная бактерия, E. coli, но многие из основных регуляторных концепций, открытых Якобом и Монодом, являются фундаментальными для клеточного регулирования во всех организмах. Основная идея заключается в том, что белки не синтезируются, когда в них нет необходимости – E. coli экономит клеточные ресурсы и энергию, не синтезируя три белка Lac, когда не требуется метаболизировать лактозу, например, при наличии других сахаров, таких как глюкоза. В следующем разделе обсуждается, как E. coli контролирует определенные гены в ответ на метаболические потребности. Во время Второй мировой войны Монод исследовал влияние комбинаций сахаров в качестве источников питательных веществ для E. coli и B. subtilis. Монод продолжал исследования, аналогичные тем, что проводились другими учеными с бактериями и дрожжами. Он обнаружил, что бактерии, выращенные на двух разных сахарах, часто демонстрируют две фазы роста. Например, если предоставляли глюкозу и лактозу одновременно, глюкоза метаболизировалась первой (фаза роста I, см. рисунок 2), а затем лактоза (фаза роста II). Лактоза не метаболизировалась в первой части диауксической кривой роста, поскольку β-галактозидаза не синтезировалась при одновременном присутствии глюкозы и лактозы в среде. Монод назвал это явление диауксией. Затем Монод сосредоточил внимание на индукции образования β-галактозидазы, которая происходила, когда лактоза была единственным сахаром в культуральной среде.

Классификация регулятивных мутантов

Концептуальный прорыв Якоба и Монода заключался в осознании различия между регуляторными веществами и участками, где они действуют, изменяя экспрессию генов. Якоб, бывший солдат, использовал аналогию с бомбардировщиком, который сбрасывает свой смертоносный груз при получении специальной радиопередачи или сигнала. Для работы системы необходимы как наземный передатчик, так и приемник в самолете. Предположим теперь, что обычный передатчик сломан. Эту систему можно заставить работать, введя второй, функциональный передатчик. В отличие от этого, он сказал, представьте бомбардировщик с неисправным приемником. На поведение этого бомбардировщика нельзя повлиять, введя второй, функциональный самолет. Для анализа регуляторных мутантов оперона lac Якоб разработал систему, позволяющую вводить вторую копию генов lac (lacI с его промотором и lacZYA с промотором и оператором) в одну клетку. Культура таких бактерий, диплоидных по генам lac, но в остальном нормальных, затем тестируется на регуляторный фенотип. В частности, определяется, синтезируются ли LacZ и LacY даже в отсутствие IPTG (из-за того, что лактозный репрессор, производимый мутантным геном, нефункционален). Этот эксперимент, в котором гены или кластеры генов тестируются попарно, называется тестом на комплементацию. Данное испытание показано на рисунке (lacA опущено для упрощения). Сначала показаны определенные гаплоидные состояния (т.е. клетка несет только одну копию генов lac). Панель (a) показывает репрессию, (b) – индукцию IPTG, а (c) и (d) – эффект мутации в гене lacI или операторе соответственно. На панели (e) показан тест на комплементацию по репрессору. Если одна копия генов lac несет мутацию в lacI, а вторая копия является диким типом по lacI, полученный фенотип нормальный, но lacZ экспрессируется при воздействии индуктора IPTG. Мутации, влияющие на репрессор, рецессивны по отношению к дикому типу (и дикий тип доминирует), что объясняется тем, что репрессор – это небольшой белок, который может диффундировать в клетке. Копия оперона lac, прилегающая к дефектному гену lacI, эффективно отключается белком, производимым второй копией lacI. Если тот же эксперимент проводится с мутацией оператора, получается другой результат (панель (f)). Фенотип клетки, несущей один мутантный и один дикий тип оператора, заключается в том, что LacZ и LacY производятся даже в отсутствие индуктора IPTG, поскольку поврежденный участок оператора не позволяет репрессору связываться и ингибировать транскрипцию структурных генов. Мутация оператора доминирует. Когда участок оператора, к которому должен связываться репрессор, поврежден мутацией, наличие второго функционального участка в той же клетке не влияет на экспрессию генов, контролируемых мутантным участком. Более сложная версия этого эксперимента использует маркированные опероны для различения двух копий генов lac и показывает, что нерегулируемый структурный ген(ы) находится(ятся) рядом с мутантным оператором (панель (g)). Например, предположим, что одна копия маркирована мутацией, инактивирующей lacZ, так что она может производить только белок LacY, а вторая копия несет мутацию, влияющую на lacY и может производить только LacZ. В этой версии только копия оперона lac, прилегающая к мутантному оператору, экспрессируется без IPTG. Мы говорим, что мутация оператора является цис-доминантной, она доминирует над диким типом, но влияет только на копию оперона, непосредственно к ней прилегающую. Это объяснение вводит в заблуждение в важном смысле, поскольку оно исходит из описания эксперимента, а затем объясняет результаты с точки зрения модели. Но на самом деле часто бывает так, что модель возникает первой, а эксперимент разрабатывается специально для ее проверки. Якоб и Монод сначала предположили, что в ДНК должен существовать участок со свойствами оператора, а затем разработали свои тесты на комплементацию, чтобы это показать. Доминирование мутаций оператора также предполагает процедуру их специфического отбора. Если регуляторные мутанты отбираются из культуры дикого типа с использованием фенил-Gal, как описано выше, мутации оператора редки по сравнению с мутациями репрессора, поскольку размер мишени очень мал. Но если вместо этого мы начнем со штамма, несущего две копии всей области lac (то есть диплоидного по lac), мутации репрессора (которые все равно возникают) не будут обнаружены, поскольку комплементация второй, диким типом lacI, обеспечивает фенотип дикого типа. В отличие от этого, мутация одной копии оператора проявляет мутантный фенотип, поскольку она доминирует над второй, диким типом копией.

A conceptual breakthrough of Jacob and Monod was to recognize the distinction between regulatory substances and sites where they act to change gene expression. A former soldier, Jacob used the analogy of a bomber that would release its lethal cargo upon receipt of a special radio transmission or signal. A working system requires both a ground transmitter and a receiver in the airplane. Now, suppose that the usual transmitter is broken. This system can be made to work by introduction of a second, functional transmitter. In contrast, he said, consider a bomber with a defective receiver. The behavior of this bomber cannot be changed by introduction of a second, functional aeroplane. To analyze regulatory mutants of the lac operon, Jacob developed a system by which a second copy of the lac genes (lacI with its promoter, and lacZYA with promoter and operator) could be introduced into a single cell. A culture of such bacteria, which are diploid for the lac genes but otherwise normal, is then tested for the regulatory phenotype. In particular, it is determined whether LacZ and LacY are made even in the absence of IPTG (due to the lactose repressor produced by the mutant gene being non functional). This experiment, in which genes or gene clusters are tested pairwise, is called a complementation test. This test is illustrated in the figure (lacA is omitted for simplicity). First, certain haploid states are shown (i. e. the cell carries only a single copy of the lac genes). Panel (a) shows repression, (b) shows induction by IPTG, and (c) and (d) show the effect of a mutation to the lacI gene or to the operator, respectively. In panel (e) the complementation test for repressor is shown. If one copy of the lac genes carries a mutation in lacI, but the second copy is wild type for lacI, the resulting phenotype is normal—but lacZ is expressed when exposed to inducer IPTG. Mutations affecting repressor are said to be recessive to wild type (and that wild type is dominant), and this is explained by the fact that repressor is a small protein which can diffuse in the cell. The copy of the lac operon adjacent to the defective lacI gene is effectively shut off by protein produced from the second copy of lacI. If the same experiment is carried out using an operator mutation, a different result is obtained (panel (f)). The phenotype of a cell carrying one mutant and one wild type operator site is that LacZ and LacY are produced even in the absence of the inducer IPTG; because the damaged operator site, does not permit binding of the repressor to inhibit transcription of the structural genes. The operator mutation is dominant. When the operator site where repressor must bind is damaged by mutation, the presence of a second functional site in the same cell makes no difference to expression of genes controlled by the mutant site. A more sophisticated version of this experiment uses marked operons to distinguish between the two copies of the lac genes and show that the unregulated structural gene(s) is(are) the one(s) next to the mutant operator (panel (g). For example, suppose that one copy is marked by a mutation inactivating lacZ so that it can only produce the LacY protein, while the second copy carries a mutation affecting lacY and can only produce LacZ. In this version, only the copy of the lac operon that is adjacent to the mutant operator is expressed without IPTG. We say that the operator mutation is cis dominant, it is dominant to wild type but affects only the copy of the operon which is immediately adjacent to it. This explanation is misleading in an important sense, because it proceeds from a description of the experiment and then explains the results in terms of a model. But in fact, it is often true that the model comes first, and an experiment is fashioned specifically to test the model. Jacob and Monod first imagined that there must be a site in DNA with the properties of the operator, and then designed their complementation tests to show this. The dominance of operator mutants also suggests a procedure to select them specifically. If regulatory mutants are selected from a culture of wild type using phenyl Gal, as described above, operator mutations are rare compared to repressor mutants because the target size is so small. But if instead we start with a strain which carries two copies of the whole lac region (that is diploid for lac), the repressor mutations (which still occur) are not recovered because complementation by the second, wild type lacI gene confers a wild type phenotype. In contrast, mutation of one copy of the operator confers a mutant phenotype because it is dominant to the second, wild type copy.

Использование в молекулярной биологии

Лак-ген и его производные пригодны для использования в качестве гена-репортера в ряде методов селекции на основе бактерий, таких как двухгибридный анализ, в котором необходимо установить успешное связывание транскрипционного активатора с конкретной промоторной последовательностью.