Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Белоктарды бөлу техникасы
Technique for separating proteins
Белок электрофорезі – сұйықтық немесе экстракттегі белоктарды талдау әдісі. Электрофорез үлгінің кішкентай көлемімен бірнеше түрлі жолмен, қолдау ортасымен (агар-агар немесе полиакриламид) немесе одансыз жүргізілуі мүмкін. Гельдік электрофорездің түрлеріне SDS PAGE, еркін ағынды электрофорез, электрофокусировка, изотахофорез, туыстық электрофорез, иммуноэлектрофорез, кері электрофорез және капиллярлық электрофорез жатады. Әр түрліліктің жеке артықшылықтары мен кемшіліктері бар көптеген кіші түрлері бар. Гельдік электрофорез жиі белгілі бір белок туралы қосымша мәлімет алу үшін электроблоттинг немесе иммуноблоттингпен бірге қолданылады.
Protein electrophoresis is a method for analysing the proteins in a fluid or an extract. The electrophoresis may be performed with a small volume of sample in a number of alternative ways with or without a supporting medium, namely agarose or polyacrylamide. Variants of gel electrophoresis include SDS PAGE, free flow electrophoresis, electrofocusing, isotachophoresis, affinity electrophoresis, immunoelectrophoresis, counterelectrophoresis, and capillary electrophoresis. Each variant has many subtypes with individual advantages and limitations. Gel electrophoresis is often performed in combination with electroblotting or immunoblotting to give additional information about a specific protein.
SDS-PAGE
SDS PAGE, натрий додецил сульфаты полиакриламид гель электрофорезі, денатүрленген (жазылған) күйде ақуыздарды электрофоретикалық жылдамдығына (полипептидтік тізбектің молекулалық салмағына байланысты) сәйкес бөлуге арналған бірнеше байланысты әдістер жиынтығын сипаттайды. Көптеген ақуыздарда SDS полипептидтік тізбекке байланысқанда масса бірлігіне шамамен бірдей зарядты бөліп береді, соның салдарынан электрофорез кезінде шамамен мөлшері бойынша фракциялану жүзеге асады. SDS – табиғи ақуыздарды жазылып, жеке полипептидтерге айналдыру үшін қолданылатын күшті жуу құралы. Ақуыз қоспасын SDS қатысуымен 100°C-қа дейін қыздырғанда, жуу құралы полипептидтік тізбектің негізгі бөлігіне оралады. Осы процесте полипептидтердің ішкі зарядтары SDS-тің салған теріс зарядтарымен салыстырғанда маңызсыз болады. Осылайша, өңделгеннен кейін полипептидтер бірқалыпты заряд тығыздығына ие, яғни бірлік ұзындықтағы бірдей теріс зарядқа ие таяқша тәрізді құрылымдарға айналады. Бұл ақуыздардың электрофоретикалық жылдамдығы олардың молекулалық салмағының логарифміне пропорционалды болады.
SDS PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, describes a collection of related techniques to separate proteins according to their electrophoretic mobility (a function of the molecular weight of a polypeptide chain) while in the denatured (unfolded) state. In most proteins, the binding of SDS to the polypeptide chain imparts an even distribution of charge per unit mass, thereby resulting in a fractionation by approximate size during electrophoresis. SDS is a strong detergent agent used to denature native proteins to unfolded, individual polypeptides. When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. In this process, the intrinsic charges of polypeptides becomes negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit length. The electrophoretic mobilities of these proteins will be a linear function of the logarithms of their molecular weights.
Туған гель әдістері
Нативті гельдер, сондай-ақ денатурацияланбаған гельдер деп те аталады, бұрынғы қалпындағы белоктарды талдайды. Осылайша, электрофоретикалық жылдамдық тек заряд пен масса арақатынасына ғана емес, сонымен қатар белоктың физикалық пішіні мен мөлшеріне де байланысты.
Native gels, also known as non denaturing gels, analyze proteins that are still in their folded state. Thus, the electrophoretic mobility depends not only on the charge to mass ratio, but also on the physical shape and size of the protein.
Көк түсті жергілікті ПАЙТА
BN PAGE – бұл туаған PAGE техникасы, онда Coomassie brilliant blue бояуы электрофоретикалық бөліну үшін ақуыз кешендеріне қажетті зарядтарды қамтамасыз етеді. Coomassie-дің кемшілігі – ол ақуыздарға байланысқанда комплекстердің ыдырауына себеп болатын детергент сияқты әрекет ете алады. Тағы бір кемшілігі – кейінгі Western blot анықтамасында немесе белсенділік сынақтарында химиялық люминесценцияның, сондай-ақ протездік топтары бар (мысалы, гема немесе хлорофилл) немесе флуоресцентті бояулармен белгіленген ақуыздардың флуоресценциясының өшу мүмкіндігі.
BN PAGE is a native PAGE technique, where the Coomassie brilliant blue dye provides the necessary charges to the protein complexes for the electrophoretic separation. The disadvantage of Coomassie is that in binding to proteins it can act like a detergent causing complexes to dissociate. Another drawback is the potential quenching of chemoluminescence (e. g. in subsequent western blot detection or activity assays) or fluorescence of proteins with prosthetic groups (e. g. heme or chlorophyll) or labelled with fluorescent dyes.
Жергілікті PAGE өшіру
CN PAGE (көбінесе Native PAGE деп аталады) полиакриламидтік градиенттік гельдегі қышқыл, суда еритін және мембраналық белоктарды бөліп шығарады. Ол зарядталған бояуды пайдаланбайды, сондықтан CN PAGE-дегі белоктардың электрофоретикалық жылдамдығы (BN PAGE зарядты өзгерту әдісінен өзгеше) белоктардың ішкі зарядымен байланысты. Миграциялық қашықтық белок зарядына, оның мөлшеріне және гельдің тесік өлшеміне тәуелді. Көп жағдайларда бұл әдіздің ажыратымдылығы BN PAGE-ге қарағанда төмен, бірақ CN PAGE, егер Кумасси бояуы келесі талдау техникаларына кедергі келтірсе, артықшылықтар ұсынады, мысалы, ол FRET талдаулары үшін өте тиімді микрокөлемдік бөлу әдісі ретінде сипатталған. Сонымен қатар, CN PAGE BN PAGE-нің қатал жағдайларын қажет етпейтіндіктен, BN PAGE-де ыдырап кететін мембраналық белок кешендерінің супрамолекулалық құрылымдарын сақтап қалуға мүмкіндік береді.
CN PAGE (commonly referred to as Native PAGE) separates acidic water soluble and membrane proteins in a polyacrylamide gradient gel. It uses no charged dye so the electrophoretic mobility of proteins in CN PAGE (in contrast to the charge shift technique BN PAGE) is related to the intrinsic charge of the proteins. The migration distance depends on the protein charge, its size and the pore size of the gel. In many cases this method has lower resolution than BN PAGE, but CN PAGE offers advantages whenever Coomassie dye would interfere with further analytical techniques, for example it has been described as a very efficient microscale separation technique for FRET analyses. Additionally, as CN PAGE does not require the harsh conditions of BN PAGE, it can retain the supramolecular assemblies of membrane protein complexes that would be dissociated in BN PAGE.
Буферлік жүйелер
Көптеген ақуызды бөлулер "үздіксіз емес" (немесе DISC) буферлік жүйе арқылы жүзеге асырылады, бұл гель ішіндегі жолақтардың айқындығын едәуір арттырады. Үздіксіз гельде электрофорез кезінде электрофорездің бастапқы кезеңінде иондық градиент пайда болады, бұл барлық ақуыздардың бір өткір жолаққа шоғырлануына себеп болады. Иондық градиентті буфердің иондары SDS-пен қапталған ақуыздарға қарағанда орташа зарядталған pH мәнін таңдау арқылы жасауға болады. Бұл жағдайларда Кольрауш реакциялары молярлық өткізгіштікті анықтайды. Нәтижесінде SDS-пен қапталған ақуыздар бірнеше минут ішінде 19 мкм шамасындағы жұқа аймақта бірнеше есеге шоғырланады. Бұл кезеңде барлық ақуыздар изотахофорез арқылы бірдей жылдамдықпен миграциялайды. Бұл гельдің үлкен тесіктері бар аймағында болады, сондықтан гель матрицасы фокустау немесе "жинақтау" кезінде миграцияны баяулатпайды. Ақуыздарды мөлшері бойынша бөлу гельдің төменгі "ажырату" аймағында жүзеге асырылады. Ажырату гелі әдетте әлдеқайда кішкентай тесіктерге ие, бұл ақуыздардың электрофоретикалық жылдамдығын анықтайтын сүзу әсеріне әкеледі. Сонымен қатар, гельдің бөлу бөлігінде де буферлік иондардың орташа зарядты алып жүретін pH мәні бар, бұл олардың SDS-пен қапталған ақуыздардан "озуына" және иондық градиентті, соның ішінде жинақтау әсерін жоюға себеп болады. Көп тараған үздіксіз буферлік жүйе – трис-глицин немесе "Laemmli" жүйесі, ол pH 6.8-де жинақтайды және pH ~8.3-9.0-да ажыратады. Бұл жүйенің кемшілігі – бұл pH мәндері ақуыздағы цистеин қалдықтары арасында дисульфидтік байланыстардың қалыптасуын ынталандыруы мүмкін, себебі цистеиннің pKa-сы 8-9 аралығында болады және жүктеме буферіндегі тотығуға қарсы агент ақуыздармен бірге миграцияламайды. Буферлеу технологиясындағы соңғы жетістіктер бұл мәселені цистеиннің pKa-сынан төмен pH-та (мысалы, bis-tris, pH 6.5) ақуыздарды ажырату арқылы шешеді және тотығуға қарсы ортаны сақтау үшін гельге ақуыздардан бұрын енетін тотығуға қарсы агенттерді (мысалы, натрий бисульфиті) қосады. pH-сы төмен буферлерді пайдаланудың қосымша артықшылығы – акриламид гелі төмен pH мәндерінде тұрақтырақ, сондықтан гельдерді пайдалану алдында ұзақ уақыт сақтауға болады.
Most protein separations are performed using a "discontinuous" (or DISC) buffer system that significantly enhances the sharpness of the bands within the gel. During electrophoresis in a discontinuous gel system, an ion gradient is formed in the early stage of electrophoresis that causes all of the proteins to focus into a single sharp band. The formation of the ion gradient is achieved by choosing a pH value at which the ions of the buffer are only moderately charged compared to the SDS coated proteins. These conditions provide an environment in which Kohlrausch's reactions determine the molar conductivity. As a result, SDS coated proteins are concentrated to several fold in a thin zone of the order of 19 μm within a few minutes. At this stage all proteins migrate at the same migration speed by isotachophoresis. This occurs in a region of the gel that has larger pores so that the gel matrix does not retard the migration during the focusing or "stacking" event. Separation of the proteins by size is achieved in the lower, "resolving" region of the gel. The resolving gel typically has a much smaller pore size, which leads to a sieving effect that now determines the electrophoretic mobility of the proteins. At the same time, the separating part of the gel also has a pH value in which the buffer ions on average carry a greater charge, causing them to "outrun" the SDS covered proteins and eliminate the ion gradient and thereby the stacking effect. A very widespread discontinuous buffer system is the tris glycine or "Laemmli" system that stacks at a pH of 6.8 and resolves at a pH of ~8.3 9.0. A drawback of this system is that these pH values may promote disulfide bond formation between cysteine residues in the proteins because the pKa of cysteine ranges from 8 9 and because reducing agent present in the loading buffer doesn't co migrate with the proteins. Recent advances in buffering technology alleviate this problem by resolving the proteins at a pH well below the pKa of cysteine (e. g., bis tris, pH 6.5) and include reducing agents (e. g. sodium bisulfite) that move into the gel ahead of the proteins to maintain a reducing environment. An additional benefit of using buffers with lower pH values is that the acrylamide gel is more stable at lower pH values, so the gels can be stored for long periods of time before use.
Белсенің SDS градиенттік гельдік электрофорезі
Кернеу қолданғанда, аниондар (және теріс зарядталған үлгі молекулалары) төменгі камерадағы оң электродқа (анодқа) қарай жылжиды, ал жетекші ион Cl− (жоғары жылдамдық және жоғары концентрация); глицинат – соңғы ион (төмен жылдамдық және төмен концентрация). SDS ақуыз бөлшектері гель буферінің Cl− және катод буферінің Gly− арасындағы шекарада еркін жылмайды. Фридрих Кольрауш Ом заңы еріген электролиттерге де қолданылатынын тапты. Cl− және глицин буферлері арасындағы кернеудің төмендеуіне байланысты ақуыздар микрометрлік қалыңдыққа ие қабаттарға сығылады (жинақталады). Шекара пора градиенті арқылы жылжиды және ақуыз жиынтығы гель матрицасының үйкеліс кедергісінің артуына байланысты біртіндеп таралады. Градиенттік гельде жинақталу және тарату әрбір ақуыз үшін әртүрлі жағдайда үздіксіз жүреді. Ақуыздың толық тарауы үшін полиакриламид гельінің концентрациясы 16% T-дан жоғары болуы керек. "Laemmli" екі гельдік жүйесі – қарапайым градиенттік гель. Буферлердің pH үздіксіздігі бөлу сапасы үшін маңызды емес, сондықтан pH-ы басқаша "жинақтау гелі" қажет емес.
As voltage is applied, the anions (and negatively charged sample molecules) migrate toward the positive electrode (anode) in the lower chamber, the leading ion is Cl− ( high mobility and high concentration); glycinate is the trailing ion (low mobility and low concentration). SDS protein particles do not migrate freely at the border between the Cl− of the gel buffer and the Gly− of the cathode buffer. Friedrich Kohlrausch found that Ohm's law also applies to dissolved electrolytes. Because of the voltage drop between the Cl− and Glycine buffers, proteins are compressed (stacked) into micrometer thin layers. The boundary moves through a pore gradient and the protein stack gradually disperses due to a frictional resistance increase of the gel matrix. Stacking and unstacking occurs continuously in the gradient gel, for every protein at a different position. For a complete protein unstacking the polyacrylamide gel concentration must exceed 16% T. The two gel system of "Laemmli" is a simple gradient gel. The pH discontinuity of the buffers is of no significance for the separation quality, and a "stacking gel" with a different pH is not needed.
Көрнекілендіру
Ең танымал белок бояуы – Кумассидің жарқыраған көк түсі. Бұл аниондық бояғыш, ол белоктарға ерекше байланыспайды. Гельдегі белоктар сірке қышқылымен бекітіледі және бір мезгілде боялады. Гельге енген артық бояуды бояусыз сол эритіндімен дестайнинг жасау арқылы жоюға болады. Белоктар ашық фонда көк жолақтар түрінде көрінеді. Егер Кумасси бояуынан гөрі сезімтал әдіс қажет болса, әдетте күміс бояу қолданылады. Күміс бояу – гельдегі белоктың азын-ана мөлшерін анықтауға арналған сезімтал процедура, сонымен қатар нуклеин қышқылы немесе полисахаридтерді де көрсетуге болады. Мысалы, Bio Rad Laboratories SDS PAGE гельдік электрофорезі үшін "бояусыз" гельдерді сатады. Сондай-ақ, Azure Biosystems-тен алынған AzureRed немесе Azure TotalStain Q сияқты қайтымды флуоресцентті бояуларды қолдануға болады. Нуклеин қышқылының гельдік электрофорезі сияқты, көбінесе бақылау бояуы қолданылады. Белгілі электрофореттік жылдамдығы бар аниондық бояулар әдетте үлгі буферіне қосылады. Бромфенол көк түсті бояу өте кең таралған. Бұл бояу сілтілік және бейтарап pH-да боялады және анодқа қарай жылжыйтын кішкентай, теріс зарядталған молекула болып табылады. Бұл өте жылдам молекула, ол көптеген белоктардың алдында жылжиды.
The most popular protein stain is Coomassie brilliant blue. It is an anionic dye, which non specifically binds to proteins. Proteins in the gel are fixed by acetic acid and simultaneously stained. The excess dye incorporated into the gel can be removed by destaining with the same solution without the dye. The proteins are detected as blue bands on a clear background. When more sensitive method than staining by Coomassie is needed, silver staining is usually used. Silver staining is a sensitive procedure to detect trace amounts of proteins in gels, but can also visualize nucleic acid or polysaccharides. For example Bio Rad Laboratories markets ”stain free” gels for SDS PAGE gel electrophoresis. Alternatively, reversible fluorescent dyes, such as those from Azure Biosystems such as AzureRed or Azure TotalStain Q can be used. Similarly as in nucleic acid gel electrophoresis, tracking dye is often used. Anionic dyes of a known electrophoretic mobility are usually included in the sample buffer. A very common tracking dye is Bromophenol blue. This dye is coloured at alkali and neutral pH and is a small negatively charged molecule that moves towards the anode. Being a highly mobile molecule it moves ahead of most proteins.