Методы разделения белков электрофорезом

Введение

Техника разделения белков

Электрофорез белков – это метод анализа белков в жидкости или экстракте. Электрофорез может быть выполнен с небольшим объемом образца различными способами, с использованием или без использования поддерживающей среды, такой как агароза или полиакриламид. Варианты гелевого электрофореза включают SDS-PAGE, электрофорез свободного потока, электрофокусирование, изотахофорез, аффинный электрофорез, иммуноэлектрофорез, контрэлектрофорез и капиллярный электрофорез. Каждый из этих вариантов имеет множество подтипов с индивидуальными преимуществами и ограничениями. Гелевый электрофорез часто сочетают с электроблоттингом или иммуноблоттингом для получения дополнительной информации об определенном белке.

СДС-СТРАНКА

SDS PAGE, полиакриламидный гель-электрофорез в додецилсульфате натрия, описывает совокупность взаимосвязанных методов разделения белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией молекулярной массы полипептидной цепи) в денатурированном (развернутом) состоянии. В большинстве белков связывание SDS с полипептидной цепью обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза. SDS – это сильное детергентное средство, используемое для денатурации нативных белков до развернутых, отдельных полипептидов. При нагревании белковой смеси до 100 °C в присутствии SDS детергент обвивает полипептидный остов. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся пренебрежимо малыми по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки приобретают форму стержневидных структур, обладающих равномерной плотностью заряда, то есть одинаковым чистым отрицательным зарядом на единицу длины. Электрофоретическая подвижность этих белков будет линейной функцией логарифмов их молекулярных масс.

Методы нативных гелей

Нативные гели, также известные как неденатурирующие гели, анализируют белки, сохраняющие свою естественную (свернутую) структуру. Таким образом, электрофоретическая подвижность зависит не только от отношения заряда к массе, но и от физической формы и размеров белка.

Синяя родина ПАЖКА

BN PAGE – это нативный метод PAGE, в котором краситель Coomassie brilliant blue обеспечивает необходимые заряды белковым комплексам для электрофоретического разделения. Недостатком Coomassie является то, что при связывании с белками он может действовать как детергент, вызывая диссоциацию комплексов. Другим недостатком является потенциальное тушение хемилюминесценции (например, при последующем обнаружении методом Western blot или в анализах активности) или флуоресценции белков, содержащих протезные группы (например, гема или хлорофилла), или меченных флуоресцентными красителями.

Очистить родную страницу

CN PAGE (обычно называемый нативным PAGE) разделяет кислые водорастворимые и мембранные белки в полиакриламидном градиентном геле. В нем не используются заряженные красители, поэтому электрофоретическая подвижность белков в CN PAGE (в отличие от метода сдвига заряда BN PAGE) связана с их собственным зарядом. Расстояние миграции зависит от заряда белка, его размера и размера пор геля. Во многих случаях этот метод обладает меньшим разрешением, чем BN PAGE, но CN PAGE предоставляет преимущества, когда краситель Кумасси мешал бы дальнейшим аналитическим методам, например, он описан как очень эффективная методика разделения в микромасштабе для анализа FRET. Кроме того, поскольку CN PAGE не требует жестких условий, как BN PAGE, он способен сохранять супрамолекулярные комплексы мембранных белковых комплексов, которые были бы диссоциированы в BN PAGE.

Буферные системы

Большинство разделений белков выполняются с использованием "дискóнтинуальной" (или DISC) буферной системы, которая значительно повышает чёткость полос в геле. Во время электрофореза в дискóнтинуальной гелевой системе на ранней стадии электрофореза формируется ионный градиент, который приводит к фокусировке всех белков в одну узкую полосу. Формирование ионного градиента достигается путём выбора значения pH, при котором ионы буфера имеют лишь умеренный заряд по сравнению с белками, покрытыми SDS. Эти условия создают среду, в которой реакции Кольрауша определяют молярную проводимость. В результате белки, покрытые SDS, концентрируются в несколько раз в тонкой зоне порядка 19 мкм в течение нескольких минут. На этой стадии все белки мигрируют с одинаковой скоростью посредством изотахофореза. Это происходит в области геля с более крупными порами, чтобы гелевая матрица не замедляла миграцию во время фокусировки или "уплотнения". Разделение белков по размеру достигается в нижней, "разрешающей" области геля. Разделяющий гель обычно имеет значительно меньший размер пор, что приводит к эффекту просеивания, который теперь определяет электрофоретическую подвижность белков. Одновременно, разделяющая часть геля также имеет значение pH, при котором буферные ионы в среднем несут больший заряд, что заставляет их "опережать" белки, покрытые SDS, и устранять ионный градиент, а следовательно, и эффект уплотнения. Широко распространённой дискóнтинуальной буферной системой является трис-глициновая или система "Laemmli", которая обеспечивает уплотнение при pH 6,8 и разделение при pH ~8,3–9,0. Недостатком этой системы является то, что эти значения pH могут способствовать образованию дисульфидных связей между остатками цистеина в белках, поскольку pKa цистеина находится в диапазоне 8–9, а восстановитель, присутствующий в загрузочном буфере, не ко-мигрирует с белками. Недавние достижения в технологии буферизации смягчают эту проблему, обеспечивая разделение белков при pH значительно ниже pKa цистеина (например, bis-tris, pH 6,5) и включая восстановители (например, бисульфит натрия), которые перемещаются в гель раньше белков, чтобы поддерживать восстановительную среду. Дополнительным преимуществом использования буферов с более низким pH является то, что акриламидный гель более стабилен при низких значениях pH, что позволяет хранить гели в течение длительного времени перед использованием.

Most protein separations are performed using a "discontinuous" (or DISC) buffer system that significantly enhances the sharpness of the bands within the gel. During electrophoresis in a discontinuous gel system, an ion gradient is formed in the early stage of electrophoresis that causes all of the proteins to focus into a single sharp band. The formation of the ion gradient is achieved by choosing a pH value at which the ions of the buffer are only moderately charged compared to the SDS coated proteins. These conditions provide an environment in which Kohlrausch's reactions determine the molar conductivity. As a result, SDS coated proteins are concentrated to several fold in a thin zone of the order of 19 μm within a few minutes. At this stage all proteins migrate at the same migration speed by isotachophoresis. This occurs in a region of the gel that has larger pores so that the gel matrix does not retard the migration during the focusing or "stacking" event. Separation of the proteins by size is achieved in the lower, "resolving" region of the gel. The resolving gel typically has a much smaller pore size, which leads to a sieving effect that now determines the electrophoretic mobility of the proteins. At the same time, the separating part of the gel also has a pH value in which the buffer ions on average carry a greater charge, causing them to "outrun" the SDS covered proteins and eliminate the ion gradient and thereby the stacking effect. A very widespread discontinuous buffer system is the tris glycine or "Laemmli" system that stacks at a pH of 6.8 and resolves at a pH of ~8.3 9.0. A drawback of this system is that these pH values may promote disulfide bond formation between cysteine residues in the proteins because the pKa of cysteine ranges from 8 9 and because reducing agent present in the loading buffer doesn't co migrate with the proteins. Recent advances in buffering technology alleviate this problem by resolving the proteins at a pH well below the pKa of cysteine (e. g., bis tris, pH 6.5) and include reducing agents (e. g. sodium bisulfite) that move into the gel ahead of the proteins to maintain a reducing environment. An additional benefit of using buffers with lower pH values is that the acrylamide gel is more stable at lower pH values, so the gels can be stored for long periods of time before use.

Градиентный гелевый электрофорез белков SDS

При приложении напряжения анионы (и отрицательно заряженные молекулы образца) мигрируют к положительному электроду (аноду) в нижней камере, лидирующим ионом является Cl− (высокая подвижность и высокая концентрация); глицинат – завершающий ион (низкая подвижность и низкая концентрация). Частицы белка SDS не мигрируют свободно на границе между Cl−-буфером геля и Gly−-буфером катода. Фридрих Колрауш обнаружил, что закон Ома применим и к растворенным электролитам. Из-за падения напряжения между Cl− и глициновым буферами белки сжимаются (уплотняются) в микрометровые слои. Граница движется по градиенту пор, а стопка белка постепенно рассеивается из-за увеличения сопротивления трению гелевой матрицы. Наложение и разложение стопки происходят непрерывно в градиентном геле, для каждого белка в разной позиции. Для полного разложения белковой стопки концентрация полиакриламидного геля должна превышать 16% T. Двухгелевая система Лаеммли представляет собой простой градиентный гель. Разрыв pH буферов не влияет на качество разделения, и "гель для наложения" с другим pH не нужен.

Визуализация

Самым популярным красителем для белков является коомассиевый синий. Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенный в гель, можно удалить обесцвечиванием тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на прозрачном фоне. Когда требуется более чувствительный метод, чем окрашивание коомассиевым синим, обычно используется серебряное окрашивание. Серебряное окрашивание – это чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях, но также может визуализировать нуклеиновые кислоты или полисахариды. Например, Bio Rad Laboratories продает гели "без красителя" для SDS-PAGE электрофореза. В качестве альтернативы могут использоваться обратимые флуоресцентные красители, такие как AzureRed или Azure TotalStain Q от Azure Biosystems. Аналогично электрофорезу гелей нуклеиновых кислот, часто используется индикаторный краситель. Анионные красители с известной электрофоретической подвижностью обычно добавляются в буфер для образцов. Очень распространенным индикаторным красителем является бромфеноловый синий. Этот краситель окрашивается в щелочной и нейтральной среде и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду. Благодаря высокой подвижности, он опережает большинство белков.