Изоэлектрлік фокустау: Молекулаларды pI бойынша бөлу әдісі
Isoelectric focusing
Изоэлектрлік фокустау (IEF) – молекулаларды изоэлектрлік нүктесі бойынша бөлу әдісі. Бұл техника белоктарды гельде pH градиенті арқылы талдауға көмектеседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Электрофорездің түрі Изоэлектрлік фокустау (IEF), сонымен қатар электрофокустау деп те аталады, – бұл әртүрлі молекулаларды олардың изоэлектрлік нүктесінің (pI) айырмашылығы бойынша бөлуге арналған техника. Бұл, әдетте, гельде жүзеге асырылатын аймақтық электрофорездің бір түрі, ол зерттелетін молекуланың жалпы зарядының ортаның pH деңгейіне байланысты екендігін пайдаланады.
Type of electrophoresis
Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing, is a technique for separating different molecules by differences in their isoelectric point (pI). It is a type of zone electrophoresis usually performed on proteins in a gel that takes advantage of the fact that overall charge on the molecule of interest is a function of the pH of its surroundings.
Процедура
IEF амфолит ерітіндісін тұрақтандырылған pH градиенті (IPG) гельдеріне қосуды қамтиды. IPG – pH градиентімен бірге полимерленген акриламид гель матрицасы, нәтижесінде ең сілтілік (>12) pH мәндерінен басқа толығымен тұрақты градиенттер пайда болады. Тұрақтандырылған pH градиенті иммобилиндер қатынасының үздіксіз өзгеруі арқылы алынады. Иммобилин – әлсіз қышқыл немесе оның pK мәнімен анықталатын негіз. Изоэлектрлік нүктесінен (pI) төмен pH аймағында орналасқан белок оң заряд алады және катодқа (жағымсыз зарядталған электродқа) қарай жылжиды. Алайда, pH-ның жоғарылауымен қозғалыс кезінде белоктың жалпы заряды оның pI-ге сәйкес келетін pH аймағына жеткенге дейін төмендейді. Бұл кезде белокте таза заряд болмайды, сондықтан қозғалыс тоқтатылады (электродтардың екеуіне де тартылыс болмайды). Нәтижесінде ақуыздар өздерінің pI-ге сәйкес келетін pH градиентіндегі нүктеде орналасқан өткір, тұрақты жолақтарға шоғырланады. Бұл әдіс өте жоғары ажыратымдылыққа ие, бір зарядпен ғана ерекшеленетін ақуыздар бөлек жолақтарда бөлінеді. Фокусталатын молекулалар pH градиенті бар ортада (әдетте, алифатикалық амфолиттер арқылы) таратылады. Орта арқылы электр тогы өткізіледі, нәтижесінде «жағымды» анод және «жағымсыз» катод жағы қалыптасады. Теріс зарядталған молекулалар ортадағы pH градиенті арқылы «жағымды» жаққа қарай жылжиды, ал оң зарядталған молекулалар «жағымсыз» жаққа қарай қозғалады. Бөлшектер зарядтың қарама-қарсы полюсіне қарай қозғалғанда, олар осы молекуланың изоэлектрлік нүктесінің pH-ына жеткенше өзгермелі pH градиенті арқылы қозғалады. Бұл кезде молекулада таза электр заряды болмайды (қатысқан функционалдық топтардың протондалуы немесе депротондалуынан) және ол гель ішінде одан әрі жылмайды. Градиентті қызығушылық тудыратын бөлшектерді қосудан бұрын, әр түрлі pI мәндері бар полиамфолиттер сияқты кіші молекулалардың ерітіндісін электрофорезге ұшырату арқылы белгілейді. Бұл әдіс көбінесе ақуыздарды зерттеуде қолданылады, олар қышқылдық және негіздік қалдықтардың салыстырмалы мөлшері бойынша бөлінеді, олардың мәні pI арқылы көрсетіледі. Ақуыздар полиакриламидтен, крахмалдан немесе агарозадан тұратын, pH градиенті белгіленген тұрақтандырылған гельге енгізіледі. Әдетте, бұл процесте әр түрлі өлшемді ақуыздардың жылжу жылдамдығының өзгешелігінен туындаған «шектеу» әсерін немесе pI-дегі артефакттарды жою үшін үлкен тесіктері бар гельдер қолданылады. Изоэлектрлік фокустау pI мәні 0,01-ге ғана өзгешеленетін ақуыздарды ажыратуға мүмкіндік береді. Изоэлектрлік фокустау – екі өлшемді гельдік электрофорездің бірінші қадамы, онда ақуыздар алдымен олардың pI-саны бойынша бөлінеді, содан кейін SDS PAGE арқылы молекулалық салмағы бойынша бөлінеді. Изоэлектрлік фокустау, керісінше, тұрақты pH-де даярлаудың жалғыз кезеңі болып табылады.
IEF involves adding an ampholyte solution into immobilized pH gradient (IPG) gels. IPGs are the acrylamide gel matrix co polymerized with the pH gradient, which result in completely stable gradients except the most alkaline (>12) pH values. The immobilized pH gradient is obtained by the continuous change in the ratio of immobilines. An immobiline is a weak acid or base defined by its pK value. A protein that is in a pH region below its isoelectric point (pI) will be positively charged and so will migrate toward the cathode (negatively charged electrode). As it migrates through a gradient of increasing pH, however, the protein's overall charge will decrease until the protein reaches the pH region that corresponds to its pI. At this point it has no net charge and so migration ceases (as there is no electrical attraction toward either electrode). As a result, the proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI. The technique is capable of extremely high resolution with proteins differing by a single charge being fractionated into separate bands. Molecules to be focused are distributed over a medium that has a pH gradient (usually created by aliphatic ampholytes). An electric current is passed through the medium, creating a "positive" anode and "negative" cathode end. Negatively charged molecules migrate through the pH gradient in the medium toward the "positive" end while positively charged molecules move toward the "negative" end. As a particle moves toward the pole opposite of its charge it moves through the changing pH gradient until it reaches a point in which the pH of that molecule's isoelectric point is reached. At this point the molecule no longer has a net electric charge (due to the protonation or deprotonation of the associated functional groups) and as such will not proceed any further within the gel. The gradient is established before adding the particles of interest by first subjecting a solution of small molecules such as polyampholytes with varying pI values to electrophoresis. The method is applied particularly often in the study of proteins, which separate based on their relative content of acidic and basic residues, whose value is represented by the pI. Proteins are introduced into an immobilized pH gradient gel composed of polyacrylamide, starch, or agarose where a pH gradient has been established. Gels with large pores are usually used in this process to eliminate any "sieving" effects, or artifacts in the pI caused by differing migration rates for proteins of differing sizes. Isoelectric focusing can resolve proteins that differ in pI value by as little as 0.01. Isoelectric focusing is the first step in two dimensional gel electrophoresis, in which proteins are first separated by their pI value and then further separated by molecular weight through SDS PAGE. Isoelectric focusing, on the other hand, is the only step in preparative native PAGE at constant pH.
Тірі жасушалар
Кейбір пікірлерге сәйкес, тірі эукариоттық жасушалар ферменттер мен олардың реагенттерінің диффузиясымен метаболизмдік реакциялардың жылдамдығының шектеуін жеңу және нақты биохимиялық процестердің жылдамдығын реттеу үшін өз ішінде белоктардың изоэлектрлік фокусталуын жүзеге асырады. Нақты метаболикалық жолдардың ферменттерін жасушаның ішкі бөлігінің шағын және бөлек аймақтарына шоғырландыру арқылы, жасуша нақты биохимиялық жолдардың жылдамдығын бірнеше есеге арттыра алады. Мысалы, фосфорилдеу немесе дефосфорилдеу арқылы фермент молекулаларының изоэлектрлік нүктесін (pI) өзгерту арқылы, жасуша фермент молекулаларын өз ішкі бөлігінің әртүрлі бөліктеріне жылдырып, нақты биохимиялық процестерді іске қосу немесе тоқтату мүмкіндігіне ие.
According to some opinions, living eukaryotic cells perform isoelectric focusing of proteins in their interior to overcome a limitation of the rate of metabolic reaction by diffusion of enzymes and their reactants, and to regulate the rate of particular biochemical processes. By concentrating the enzymes of particular metabolic pathways into distinct and small regions of its interior, the cell can increase the rate of particular biochemical pathways by several orders of magnitude. By modification of the isoelectric point (pI) of molecules of an enzyme by, e. g., phosphorylation or dephosphorylation, the cell can transfer molecules of the enzyme between different parts of its interior, to switch on or switch off particular biochemical processes.
Микрофлюидті чип негізінде
Микрочиптік электрофорез капиллярлық электрофорезге перспективті балама болып табылады, себебі ол жылдам ақуыз талдауын, басқа микрофлюидтік операциялармен оңай интеграциялауды, арнаның толық көлемін анықтауды, нитроцеллюлоза пленкаларын пайдалануды, үлгілердің кіші көлемін және өндіріс шығындарын төмендету мүмкіндігін ұсынады.
Microchip based electrophoresis is a promising alternative to capillary electrophoresis since it has the potential to provide rapid protein analysis, straightforward integration with other microfluidic unit operations, whole channel detection, nitrocellulose films, smaller sample sizes and lower fabrication costs.
Көп буыны бар
Белсенділерді жылдам және қолдануға оңай ақуызды бөлу құралдарына деген сұраныстың артуы IEF-тің ерітіндідегі бөлінуге қарай дамуын үдетті. Осы ретте, жылдам және гельсіз IEF бөлуді жүзеге асыру үшін көптөгкейлі IEF жүйесі әзірленді. Көптөгкейлі IEF жүйесі әр ыдыстан өтетін капиллярлы ыдыстардың тізбесін пайдаланады және Альцгеймер ауруымен ауырған науқастардың қан плазмасының ақуыздары биомаркерлерді табу үшін қолданылады.
The increased demand for faster and easy to use protein separation tools has accelerated the evolution of IEF towards in solution separations. In this context, a multi junction IEF system was developed to perform fast and gel free IEF separations. The multi junction IEF system utilizes a series of vessels with a capillary passing through each vessel. and blood plasma proteins from Alzheimer's disease patients for biomarker discovery.