Изоэлектрическое фокусирование: принцип и применение.

Введение

Тип электрофореза

Изоэлектрическое фокусирование (IEF), также известное как электрофокусирование, — это метод разделения различных молекул на основе различий в их изоэлектрической точке (pI). Это разновидность зонального электрофореза, обычно проводимая с белками в геле, использующая тот факт, что суммарный заряд молекулы зависит от pH окружающей среды.

Процедура

IEF включает добавление раствора амфолитов в гели с иммобилизованным градиентом pH (IPG). IPG – это матрица геля акриламида, сополимеризованная с градиентом pH, что обеспечивает формирование полностью стабильных градиентов, за исключением наиболее щелочных значений pH (>12). Иммобилизованный градиент pH достигается за счет непрерывного изменения соотношения иммобилинов. Иммобилин – это слабая кислота или основа, определяемая ее значением pK. Белок, находящийся в области pH ниже своей изоэлектрической точки (pI), будет нести положительный заряд и, следовательно, мигрировать к катоду (отрицательно заряженному электроду). Однако, по мере миграции через градиент возрастающего pH, общий заряд белка будет уменьшаться, пока белок не достигнет области pH, соответствующей его pI. В этой точке у него отсутствует чистый заряд, и миграция прекращается (так как нет электрического притяжения к какому-либо электроду). В результате белки фокусируются в узкие, неподвижные полосы, причем каждый белок занимает положение в градиенте pH, соответствующее его pI. Метод обладает чрезвычайно высоким разрешением, позволяя разделять белки, различающиеся всего на один заряд. Молекулы, подлежащие фокусировке, распределяются в среде с градиентом pH (обычно создаваемым алифатическими амфолитами). Через среду пропускают электрический ток, создавая "положительный" анод и "отрицательный" катод. Отрицательно заряженные молекулы мигрируют через градиент pH к "положительному" концу, а положительно заряженные – к "отрицательному". По мере движения частицы к полюсу, противоположному ее заряду, она проходит через изменяющийся градиент pH, пока не достигнет точки, в которой pH соответствует изоэлектрической точке этой молекулы. В этой точке молекула больше не имеет чистого электрического заряда (из-за протонирования или депротонирования связанных функциональных групп) и, следовательно, не продвигается дальше в геле. Градиент устанавливается перед добавлением интересующих частиц путем электрофореза раствора небольших молекул, таких как полиамфолиты с различными значениями pI. Метод особенно часто применяется в изучении белков, которые разделяются на основе относительного содержания кислых и основных остатков, значение которых отражается в pI. Белки вводят в иммобилизованный гель с градиентом pH, состоящий из полиакриламида, крахмала или агарозы, где предварительно сформирован градиент pH. В этом процессе обычно используют гели с большими порами, чтобы исключить "эффект просеивания" или артефакты в pI, вызванные различиями в скорости миграции белков разного размера. Изоэлектрическое фокусирование позволяет разделять белки, различающиеся по значению pI всего на 0,01. Изоэлектрическое фокусирование является первым этапом двухмерного гелевого электрофореза, в котором белки сначала разделяются по значению pI, а затем дополнительно разделяются по молекулярной массе с помощью SDS-PAGE. С другой стороны, изоэлектрическое фокусирование является единственным этапом препаративной нативной ПАГЭ при постоянном pH.

IEF involves adding an ampholyte solution into immobilized pH gradient (IPG) gels. IPGs are the acrylamide gel matrix co polymerized with the pH gradient, which result in completely stable gradients except the most alkaline (>12) pH values. The immobilized pH gradient is obtained by the continuous change in the ratio of immobilines. An immobiline is a weak acid or base defined by its pK value. A protein that is in a pH region below its isoelectric point (pI) will be positively charged and so will migrate toward the cathode (negatively charged electrode). As it migrates through a gradient of increasing pH, however, the protein's overall charge will decrease until the protein reaches the pH region that corresponds to its pI. At this point it has no net charge and so migration ceases (as there is no electrical attraction toward either electrode). As a result, the proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI. The technique is capable of extremely high resolution with proteins differing by a single charge being fractionated into separate bands. Molecules to be focused are distributed over a medium that has a pH gradient (usually created by aliphatic ampholytes). An electric current is passed through the medium, creating a "positive" anode and "negative" cathode end. Negatively charged molecules migrate through the pH gradient in the medium toward the "positive" end while positively charged molecules move toward the "negative" end. As a particle moves toward the pole opposite of its charge it moves through the changing pH gradient until it reaches a point in which the pH of that molecule's isoelectric point is reached. At this point the molecule no longer has a net electric charge (due to the protonation or deprotonation of the associated functional groups) and as such will not proceed any further within the gel. The gradient is established before adding the particles of interest by first subjecting a solution of small molecules such as polyampholytes with varying pI values to electrophoresis. The method is applied particularly often in the study of proteins, which separate based on their relative content of acidic and basic residues, whose value is represented by the pI. Proteins are introduced into an immobilized pH gradient gel composed of polyacrylamide, starch, or agarose where a pH gradient has been established. Gels with large pores are usually used in this process to eliminate any "sieving" effects, or artifacts in the pI caused by differing migration rates for proteins of differing sizes. Isoelectric focusing can resolve proteins that differ in pI value by as little as 0.01. Isoelectric focusing is the first step in two dimensional gel electrophoresis, in which proteins are first separated by their pI value and then further separated by molecular weight through SDS PAGE. Isoelectric focusing, on the other hand, is the only step in preparative native PAGE at constant pH.

Живые клетки

Согласно некоторым мнениям, живые эукариотические клетки осуществляют изоэлектрическое фокусирование белков внутри себя для преодоления ограничения скорости метаболических реакций, обусловленного диффузией ферментов и их реагентов, а также для регуляции скорости конкретных биохимических процессов. Концентрируя ферменты определенных метаболических путей в четко определенных и небольших областях своего внутреннего пространства, клетка может увеличить скорость этих биохимических путей на несколько порядков. Путем изменения изоэлектрической точки (pI) молекул фермента, например, посредством фосфорилирования или дефосфорилирования, клетка может перемещать молекулы фермента между различными частями своего внутреннего пространства, тем самым включая или выключая определенные биохимические процессы.

на основе микрофлюидных чипов

Электрофорез на микрочипах является перспективной альтернативой капиллярному электрофорезу благодаря потенциальной возможности быстрого анализа белков, простой интеграции с другими микрофлюидными операциями, детектированию по всей длине канала, использованию нитроцеллюлозных пленок, уменьшенным объемам образцов и сниженным затратам на изготовление.

Многоконтактные

Увеличенный спрос на более быстрые и удобные инструменты для разделения белков ускорил эволюцию IEF в направлении разделения в растворе. В связи с этим была разработана многопереходная система IEF для быстрого и безгелевого разделения белков методом IEF. Многопереходная система IEF использует серию сосудов, через каждый из которых проходит капилляр, и применяется для анализа белков плазмы крови пациентов с болезнью Альцгеймера с целью поиска биомаркеров.