Кіріспе
Клеткалардан ДНК-ны оқшаулау процесінің әр түрлі әдістері
the various methods
Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНК) алғаш рет 1869 жылы Фридрих Мишер оқшаулады. ДНК-ны алу – бұл организмнің жасушаларынан ДНК-ны үлгіден, әдетте қан, сілекей немесе тінді сияқты биологиялық материалдан бөліп алу процесі. Ол жасушаларды бөлшектеуді, ақуыздар және басқа да қоспаларды жоюды, сондай-ақ ДНК-ны басқа жасушалық компоненттерден тазалауды қамтиды. Тазартылған ДНК кейін ПТР, секвенирлеу немесе клондау сияқты келесі кезеңдерде қолдануға болады. Қазіргі уақытта молекулалық биологияда немесе сот-медициналық сараптамада бұл стандартты процедура. Бұл процесті үлгі түріне және қолдану мақсатына байланысты әр түрлі жолдармен жүзеге асыруға болады. Ең көп таралған әдістер: механикалық, химиялық және ферменттік лизис, тұндыру, тазарту және концентрация. ДНК-ны алу үшін фенол-хлороформ экстракциясы, спирттік тұндыру немесе кремний негізді тазарту сияқты арнайы әдістер қолданылады. Химиялық әдіс үшін көптеген әртүрлі жиынтықтар қолданылады, дұрыс жиынтықты таңдау жиынтықты оңтайландыру және экстракция процедураларында уақытты үнемдеуге көмектеседі. Коммерциялық жиынтықтардың арасындағы айырмашылықты көрсету үшін ПТР сезімталдығын анықтау маңызды. ДНК-ны алудың көптеген әдістері бар, бірақ кейбір негізгі қадамдар мыналарды қамтиды:
Лизис: Бұл қадам ДНК-ны босату үшін жасушаларды бөлшектеуді қамтиды. Мысалы, бактериялық жасушалар үшін жасуша мембранасын бұзу және ДНК-ны босату үшін жуғыш зат пен тұз ерітіндісі (мысалы, SDS) қолданылуы мүмкін. Өсімдік және жануар жасушалары үшін көбінесе механикалық немесе ферменттік әдістер қолданылады. Тұндыру: ДНК-ны босатқаннан кейін, ақуыздар мен басқа қоспаларды жою қажет. Бұл әдетте спирт (этанол немесе изопропанол сияқты) немесе тұз (мысалы, аммоний ацетаты) сияқты тұндырғыш қосу арқылы жасалады. ДНК ерітіндінің түбінде шөкпе түзеді, ал қоспалар сұйықтықта қалады. Тазарту: ДНК тұндырылғаннан кейін, оны әдетте бағаналық әдістерді қолдану арқылы одан әрі тазартады. Мысалы, кремний негізді спин-бағаналарын ДНК-ны байланыстыру үшін пайдалануға болады, ал қоспалар жуылады. Сонымен қатар, ДНК-ны түтікшенің түбіне орау арқылы тазарту үшін центрифугалау кезеңін қолдануға болады. Концентрация: Соңында, ДНК мөлшерін арттыру үшін қалған сұйықтық жойылады. Бұл әдетте вакуумдық центрифугалау немесе лиофилизация (мұздату кептіру) арқылы жасалады. Нақты ДНК экстракция протоколына байланысты осы қадамдардың кейбір вариациялары қолданылуы мүмкін екенін атап өткен жөн. Сонымен қатар, нақты бір үлгі түріне арналған реагенттер мен протоколдарды қамтитын коммерциялық жиынтықтар бар.
Ол нені ұсынады?
ДНҚ алу жиі қоршаған ортадағы вирустар мен бактерияларды анықтау және аурулар мен тұқым қуалайтын ауруларды диагностикалау үшін қолданылатын көптеген диагностикалық процедуралардың бастапқы қадамы болып табылады. Бұл әдістерге мыналар кіреді, бірақ олармен шектелмейді: Флуоресценттік ин ситу гибридтеу (FISH) әдісі 1980-ші жылдары жасалды. Негізгі идея – интерфазалық жасушалардан немесе микроскоптық слайдқа жабысқан метафазалық хромосомалардан ядролық ДНҚ-ны гибридтеу үшін нуклеин қышқылы зондын пайдалану. Бұл молекулалық әдіс, басқа нәрселермен қатар, нақты бактериялық топтарды анықтау және сану үшін қолданылады.
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) technique was developed in the 1980s. The basic idea is to use a nucleic acid probe to hybridize nuclear DNA from either interphase cells or metaphase chromosomes attached to a microscopic slide. It is a molecular method used, among other things, to recognize and count particular bacterial groupings.
Негізгі рәсім
Зерттеуге арналған жасушаларды жинау қажет. Жасуша мембранасын бұзу ДНК-ны және цитоплазманы ашыққа шығарады (жасуша лизисі). Жасуша мембранасы мен ядроның липидтері жуғыш заттар (detergent) және беттік белсенді заттар (surfactant) арқылы ыдырайды. Протеиндерді протеаза қосып ыдырату (қосымша). РНҚ-ны RNase қосып ыдырату (қосымша). Ерітінді концентрацияланған тұз ерітіндісімен (тұздық) өңделеді, нәтижесінде сынған ақуыздар, липидтер және РНҚ сияқты қалдықтар бірігіп, түйіндейді. Ерітіндіні центрифугалау ұяшықтық қалдықтарды ДНК-дан бөліп алады. Жасуша лизисі кезеңінде ДНК-ны жуғыш заттардан, ақуыздардан, тұздардан және реагенттерден тазарту жүзеге асырылады. Ең көп қолданылатын процедуралар: Этанолмен тұндыру, әдетте, мұздай суық этанол немесе изопропанол арқылы. ДНК осы спирттерде ерімейтіндіктен, бірігіп, центрифугалау кезінде шөгінді (пеллет) береді. ДНК тұндырылымын иондық күштілікті арттыру арқылы жақсартуға болады, әдетте натрий ацетатын қосу арқылы. Фенол-хлороформ экстракциясы, онда фенол үлгідегі ақуыздарды денатурациялайды. Үлгіні центрифугадан өткізгеннен кейін денатурацияланған ақуыздар органикалық фазада қалады, ал нуклеин қышқылы бар сулы фаза хлороформмен араластырылып, ерітіндіден фенол қалдықтары алынады. Микроколонкалық тазарту нуклеин қышқылдарының буфердің pH және тұз концентрациясына байланысты қатты фазаға (кремний немесе басқа) сіңуіне (адсорбция) негізделген. ДНК-ға байланысқан жасушалық және гистондық ақуыздарды протеаза қосу арқылы, натрий немесе аммоний ацетатымен ақуыздарды тұндыру арқылы немесе ДНК тұндырылуына дейін фенол-хлороформ қоспасымен экстракциялау арқылы жоюға болады. Оқшауланғаннан кейін ДНК сәл сілтілі буферде, әдетте TE буферінде немесе таза суда ерітіледі.
Ethanol precipitation usually by ice cold ethanol or isopropanol. Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation. Precipitation of DNA is improved by increasing ionic strength, usually by adding sodium acetate. Phenol–chloroform extraction in which phenol denatures proteins in the sample. After centrifugation of the sample, denatured proteins stay in the organic phase while the aqueous phase containing nucleic acid is mixed with chloroform to remove phenol residues from the solution. Minicolumn purification relies on the fact that the nucleic acids may bind (adsorption) to the solid phase (silica or other) depending on the pH and the salt concentration of the buffer. Cellular and histone proteins bound to the DNA can be removed either by adding a protease or having precipitated the proteins with sodium or ammonium acetate or extracted them with a phenol chloroform mixture before the DNA precipitation. After isolation, the DNA is dissolved in a slightly alkaline buffer, usually in a TE buffer, or in ultra pure water.
ДНҚ-ны анықтау
Дифениламин (DPA) индикаторы ДНК-ның бар екенін растайды. Бұл процедура ДНК-ның химиялық гидролизінен тұрады: қышқылда қыздырылғанда (мысалы, ≥95 °C), реакцияға дезоксирибоза қанты қажет, сондықтан ол ДНК-ға ғана тән. Осы жағдайда 2-дезоксирибоза w-гидроксилевулинил альдегидіне айналады, ол дифениламин қосылысымен әрекеттесіп, көк түсті қосылыс түзеді. ДНК концентрациясын 600 нм толқын ұзындығында спектрофотометрмен ерітіндінің сіңіру интенсивтілігін өлшеу және белгілі ДНК концентрацияларының стандартты қисығымен салыстыру арқылы анықтауға болады. ДНК тазалығын бағалау үшін 260 нм және 280 нм толқын ұзындықтарында ДНК ерітіндісінің сіңіру интенсивтілігі өлшенеді. ДНК-ны рестрикциялық ферментпен кесіп, агароза гелінде жүргізіп, этидий бромид (EtBr) немесе басқа бояумен бояп, ДНК-ның интенсивтілігін белгілі концентрациядағы ДНК маркерімен салыстыру арқылы мөлшерлеуге болады. Southern blot әдісін қолдану арқылы осы мөлшерленген ДНК-ны оқшаулап, ПЦР және RFLP талдауларын жүргізу арқылы одан әрі зерттеуге болады. Бұл процедуралар геномдағы қайталанатын тізбектерді ажыратуға мүмкіндік береді. Сот-медициналық сарапшылар осы техникаларды салыстыру, идентификациялау және талдау үшін пайдаланады.
Жоғары молекулалық салмақты ДНК экстракциялау әдісі
Бұл әдісте өсімдік ядролары тіндерді физикалық түрде ұнтақтау және толық ядроларды ерекше ядролық оқшаулау буферінде (NIB) қайта құру арқылы бөліп алынады. Пластид ДНК органеллалардан босатылып, жуу және центрифугалау арқылы осмостық буфермен бірге жойылады. Тазартылған ядролар лизистеліп, органикалық экстракциямен қосымша тазартылады, ал геномдық ДНК жоғары концентрациялы CTAB арқылы тұндырылады. Өте таза, жоғары молекулалық салмақты гДНК ядролардан алынып, жоғары pH буферінде ерітіледі, бұл ұзақ мерзімді тұрақты сақтауға мүмкіндік береді.
ДНҚ сақтау
ДНҚ сақтау – ДНҚ экстракциялау жобаларының маңызды аспектісі болып табылады, себебі ол алынған ДНҚ-ның тұтастығы мен тұрақтылығын келесі қолданыстар үшін қамтамасыз етеді. ДНҚ сақтаудың бір әдеттегі әдісі – этанол преципитациясы, ол этанол мен тұзды (мысалы, натрий хлориді немесе калий ацетаты) алынған ДНҚ-ға қосып, оны ерітіндіден тұндыруды қамтиды. Содан кейін ДНҚ центрифугалау арқылы түйірлендіріліп, қалған ластанушы заттарды жою үшін 70% этанолмен жуылады. ДНҚ түйіршігі ауада кептіріліп, Tris EDTA (TE) буферінде сақталады. Тағы бір әдіс – ДНҚ-ны TE буфері сияқты буферде немесе глицерин немесе ДМСО сияқты криопротекторда -20 немесе -80 градус Цельсийде қатыру. Бұл әдіс ДНҚ-ның тұтастығын сақтайды және оны ыдыратуға болатын ферменттердің активтілігін баяулатады. Сақтау буферін және жағдайын таңдау ДНҚ қолданылатын келесі мақсатқа байланысты екенін ескеру маңызды. Мысалы, егер ДНҚ ПТР үшін қолданылса, оны 4 градус Цельсийдегі TE буферінде сақтауға болады, ал ұзақ мерзімді сақтау немесе тасымалдау үшін -20 градус Цельсийдегі этанолда сақтауға болады. Экстракцияланған ДНҚ-ның сапасы мен тұтастығын, мысалы, гельдік электрофорез немесе спектрофотометрия арқылы үнемі тексеру қажет. Сақтау жағдайларын, мысалы температура мен ылғалдылықты да қадағалап, бақылау керек. ДНҚ-ның ұзақ мерзімді тұрақтылығы және уақыт өте ыдырау мүмкіндігі де ескерілуі тиіс. Алынған ДНҚ мүмкіндігінше аз уақыт сақталуы керек, ал сақтау жағдайлары ыдырау қаупін азайту үшін таңдалуы керек. Жалпы алғанда, алынған ДНҚ-ны келесі қолданыстар үшін тұрақтылығы мен тұтастығын қамтамасыз ету үшін ең қолайлы жағдайда сақтау керек.