Введение

Процесс выделения ДНК из клеток различными методами

Первая изоляция дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) была осуществлена в 1869 году Фридрихом Мишером. Экстракция ДНК – это процесс выделения ДНК из клеток организма, полученный из образца, как правило, биологического, такого как кровь, слюна или ткань. Он включает в себя разрушение клеток, удаление белков и других примесей, а также очистку ДНК для отделения ее от других клеточных компонентов. Очищенная ДНК затем может быть использована для последующих применений, таких как ПЦР, секвенирование или клонирование. В настоящее время это стандартная процедура в молекулярной биологии и судебно-медицинском анализе. Этот процесс может выполняться различными способами, в зависимости от типа образца и последующего применения, наиболее распространенными методами являются: механический, химический и ферментативный лизис, осаждение, очистка и концентрирование. Конкретный метод, используемый для выделения ДНК, может включать экстракцию фенолом хлороформом, осаждение спиртом или очистку на основе кремния. Для химического метода существует множество различных наборов для экстракции, и выбор подходящего позволит сэкономить время на оптимизации набора и процедурах экстракции. Определение чувствительности ПЦР считается способом выявления различий между коммерческими наборами. Существует множество различных методов выделения ДНК, но некоторые общие этапы включают:

Лизис: Этот этап включает разрушение клеток для высвобождения ДНК. Например, в случае бактериальных клеток можно использовать раствор детергента и соли (например, SDS) для разрушения клеточной мембраны и высвобождения ДНК. Для растительных и животных клеток часто используются механические или ферментативные методы. Осаждение: После высвобождения ДНК необходимо удалить белки и другие примеси. Обычно это делается путем добавления осаждающего агента, такого как спирт (например, этанол или изопропанол) или соль (например, ацетат аммония). ДНК образует осадок на дне раствора, а примеси остаются в жидкости. Очистка: После осаждения ДНК обычно дополнительно очищается с использованием колоночных методов. Например, спиновые колонки на основе кремния могут использоваться для связывания ДНК, в то время как примеси удаляются промывкой. В качестве альтернативы можно использовать центрифугирование для очистки ДНК путем осаждения ее на дно пробирки. Концентрирование: Наконец, количество присутствующей ДНК обычно увеличивается путем удаления оставшейся жидкости. Обычно это делается с помощью вакуумной центрифуги или лиофилизации (сублимационной сушки). Стоит отметить, что в зависимости от конкретного протокола экстракции ДНК могут использоваться некоторые вариации этих этапов. Кроме того, в продаже имеются коммерческие наборы, содержащие реагенты и протоколы, специально разработанные для конкретного типа образца.

Что она доставляет?

Экстракция ДНК часто является предварительным этапом во многих диагностических процедурах, используемых для идентификации вирусов и бактерий окружающей среды, а также для диагностики заболеваний и наследственных болезней. Эти методы включают, но не ограничиваются следующим:

Техника флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) была разработана в 1980-х годах. Основная идея заключается в использовании нуклеинокислотного зонда для гибридизации с ядерной ДНК из интерфазных клеток или метафазных хромосом, нанесенных на предметное стекло микроскопа. Это молекулярный метод, используемый, в частности, для распознавания и подсчета определенных бактериальных групп.

Основная процедура

Необходимо собрать клетки для исследования. Разрыв клеточных мембран высвобождает ДНК вместе с цитоплазмой (клеточный лиз). Липиды клеточной мембраны и ядра разрушаются с помощью детергентов и поверхностно-активных веществ. Расщепление белков путем добавления протеазы (необязательно). Разрушение РНК путем добавления РНКазы (необязательно). Раствор обрабатывается концентрированным солевым раствором, чтобы обломки, такие как разрушенные белки, липиды и РНК, агрегировались. Центрифугирование раствора отделяет скомканные клеточные остатки от ДНК. Очистка ДНК от детергентов, белков, солей и реагентов проводится на этапе клеточного лизиса. Наиболее часто используемые методы:
Осаждение этанолом, обычно ледяным этанолом или изопропанолом. Поскольку ДНК нерастворима в этих спиртах, она агрегирует, образуя осадок при центрифугировании. Осаждение ДНК улучшается повышением ионной силы, обычно путем добавления ацетата натрия. Экстракция фенолом-хлороформом, в ходе которой фенол денатурирует белки в образце. После центрифугирования образца денатурированные белки остаются в органической фазе, а водная фаза, содержащая нуклеиновые кислоты, смешивается с хлороформом для удаления остатков фенола из раствора. Очистка с помощью миниколонок основана на способности нуклеиновых кислот связываться (адсорбироваться) с твердой фазой (кремнезем или другой) в зависимости от pH и концентрации соли в буфере. Клеточные и гистонные белки, связанные с ДНК, могут быть удалены либо добавлением протеазы, либо осаждением белков ацетатом натрия или аммония, либо экстракцией смесью фенола и хлороформа перед осаждением ДНК. После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в буфере TE, или в ультрачистой воде.

Обнаружение ДНК

Дифениламин (DPA) подтвердит наличие ДНК. Эта процедура включает химический гидролиз ДНК: при нагревании (например, ≥95 °C) в кислой среде реакция требует дезоксирибозного сахара и, следовательно, специфична для ДНК. В этих условиях 2-дезоксирибоза превращается в ω-гидроксилевулинилальдегид, который реагирует с дифениламином, образуя соединение синего цвета. Концентрация ДНК может быть определена путем измерения интенсивности поглощения раствора при 600 нм с помощью спектрофотометра и сравнения с эталонной кривой известных концентраций ДНК. Измерение интенсивности поглощения раствора ДНК при длинах волн 260 нм и 280 нм используется для оценки чистоты ДНК. Количественное определение ДНК может быть выполнено путем расщепления ДНК рестрикционным ферментом, электрофореза в агарозном геле, окрашивания бромидом этидия (EtBr) или другим красителем и сравнения интенсивности полос ДНК с маркером ДНК известной концентрации. С помощью метода Саузерн-блотта эту количественно определенную ДНК можно изолировать и далее исследовать с использованием ПЦР и RFLP-анализа. Эти процедуры позволяют дифференцировать повторяющиеся последовательности в геноме. Именно эти методы используют специалисты криминалистической экспертизы для сравнения, идентификации и анализа.

Метод экстракции ДНК высокой молекулярной массы

В этом методе ядра растений изолируют путем физического измельчения тканей и восстановления целостности ядер в уникальном буфере для изоляции ядер (NIB). ДНК пластид высвобождается из органелл и удаляется с помощью осмотического буфера посредством промывки и центрифугирования. Очищенные ядра затем лизируют и дополнительно очищают органической экстракцией, после чего геномная ДНК осаждается с использованием высокой концентрации CTAB. Высокочистая гДНК с высокой молекулярной массой извлекается из ядер, растворяется в буфере с высоким pH, что обеспечивает стабильное длительное хранение.

Хранение ДНК

Хранение ДНК является важным аспектом проектов по выделению ДНК, поскольку обеспечивает сохранность и стабильность выделенной ДНК для последующих применений. Одним из распространенных методов хранения ДНК является осаждение этанолом, которое заключается в добавлении этанола и соли, такой как хлорид натрия или ацетат калия, к выделенной ДНК для осаждения ее из раствора. Затем ДНК осаждается центрифугированием и промывается 70% этанолом для удаления остаточных загрязнений. Полученный осадок ДНК высушивается на воздухе и ресуспендируется в буфере, например, в буфере Tris-EDTA (TE), для хранения. Другой метод – замораживание ДНК в буфере, таком как буфер TE, или в криопротекторе, таком как глицерин или ДМСО, при -20 или -80 градусах Цельсия. Этот метод сохраняет целостность ДНК и замедляет активность ферментов, которые могут ее разрушать. Важно отметить, что выбор буфера для хранения и условий будет зависеть от дальнейшего применения ДНК. Например, если ДНК будет использоваться для ПЦР, ее можно хранить в буфере TE при 4 градусах Цельсия, а для длительного хранения или транспортировки – в этаноле при -20 градусах Цельсия. Выделенную ДНК следует регулярно проверять на качество и целостность, например, с помощью электрофореза в агарозном геле или спектрофотометрии. Также необходимо отслеживать и контролировать условия хранения, такие как температура и влажность. Важно учитывать долгосрочную стабильность ДНК и возможность ее деградации со временем. Выделенную ДНК следует хранить как можно более короткое время, а условия хранения следует выбирать таким образом, чтобы минимизировать риск деградации. В целом, выделенную ДНК следует хранить в оптимальных условиях для обеспечения ее стабильности и целостности для последующих применений.