Капиллярлық электрофорез әдісі

Кіріспе

Химиялық немесе биологиялық үлгілерді бөлу әдісі

Капиллярлық электрофорез (CE) – субмиллиметрлік диаметрлі капиллярларда және микро- және нанофлюидтік каналдарда жүзеге асырылатын электрокинетикалық бөлу әдістерінің тобы. Көп жағдайда CE капиллярлық аймақтық электрофорезге (CZE) сілтеме жасайды, бірақ капиллярлық гель электрофорезі (CGE), капиллярлық изоэлектрлік фокустау (CIEF), капиллярлық изотахофорез және мицеллярлық электрокинетикалық хроматография (MEKC) сияқты басқа электрофоретикалық техникалар да осы әдістер класына жатады. CE әдістерінде аналиттер электр өрісінің әсерімен электролит ерітінділерінде қозғалады. Аналиттер иондық жылдамдық және/немесе ковалентті емес өзара әрекеттесулер арқылы басқа фазаға бөліну арқылы ажыратылуы мүмкін. Бұдан өзге, аналиттер өткізгіштік және pH градиенттерін пайдалану арқылы шоғырландырылуы немесе "фокусталуы" мүмкін.

Аспаптар

Капиллярлық электрофорезді жүзеге асыруға қажетті құрал-жабдық салыстырмалы түрде қарапайым. Капиллярлық электрофорез жүйесінің негізгі схемасы 1-суретте көрсетілген. Жүйенің негізгі компоненттері: сынама флаконы, бастапқы және соңғы флакон, капилляр, электродтар, жоғары кернеулі қуат көзі, детектор және деректерді шығару және өңдеу құрылғысы. Бастапқы флакон, соңғы флакон және капилляр электролитпен, мысалы, сулы буферлік ерітіндімен толтырылады. Сынаманы енгізу үшін капиллярдың кіреберісі сынамасы бар флаконға салынады. Сынама капиллярлық әсер, қысым, сифондау немесе электрокинетикалық түрде капиллярға енгізіледі, содан кейін капилляр бастапқы флаконға қайтарылады. Аналиттердің қозғалысы бастапқы және соңғы флакон арасында қолданылатын электр өрісімен басталады, ал қуат көзі арқылы электродтарға беріледі. Капиллярлық электрофорездің ең көп таралған режимінде барлық иондар, оң немесе теріс, электроосмостық ағым арқылы капилляр бойымен бір бағытта тартылады. Аналиттер электрофоретикалық жылдамдығына байланысты қозғалғанда бөлінеді және капиллярдың шығу жағына жақын анықталады. Детектордың нәтижесі интегратор немесе компьютер сияқты деректерді шығару және өңдеу құрылғысына жіберіледі. Деректер электроферограмма түрінде көрсетіледі, ол детектордың жауабын уақытқа байланысты көрсетеді. Бөлінген химиялық қосылыстар электроферограммада әртүрлі қозғалыс уақыттары бар шыңдар түрінде көрінеді. Бұл әдіс көбінесе Джеймс В. Йоргенсен мен Кринн ДеАрман Лукацқа жатқызылады, олар алғаш рет осы әдістің мүмкіндіктерін көрсетті. Капиллярлық электрофорезді алғаш рет Ричард Д. Смит және оның әріптестері массалық спектрометриямен біріктірді, бұл өте кішкентай сынама көлемін талдау үшін өте жоғары сезімталдықпен мүмкіндік берді. Сынама көлемі өте кішкентай болғанына қарамастан (әдетте капиллярға бірнеше нанолитр ғана сұйықтық енгізіледі), жоғары сезімталдық пен өткір шыңдар инъекциялық стратегиялардың нәтижесінде капиллярдың кіреберісіне жақын аналиттердің шоғырлануына байланысты қол жеткізіледі. Бұл қысыммен немесе электрокинетикалық инъекция арқылы жүзеге асырылады, сынаманы жұмыс істеп тұрған буферге қарағанда төмен өткізгіштігі бар буферде (мысалы, төмен тұз концентрациясы) ерітіп қою арқылы. Өріс күшейтілген сынаманы үйіру (изотахофорез түрі) процесі төмен өткізгіштігі бар сынама мен жоғары өткізгіштігі бар жұмыс істеп тұрған буфер арасындағы шекарада аналиттің шоғырлануына әкеледі. Сынама өнімділігін арттыру үшін көптеген капиллярлар массиві бар құралдар қолданылады. Мұндай капиллярлық массив электрофорезі (CAE) құралдары 16 немесе 96 капиллярлы капиллярлық ДНК тізбегін орташа және жоғары өнімділікпен жүргізуге қолданылады, ал капиллярлардың кіреберіс жақтары SBS стандартындағы 96 ұялы табақтардан тікелей сынама қабылдау үшін кеңістікте орналастырылған. Құрал-жабдықтың кейбір аспектілері (мысалы, анықтау) бір капиллярлық жүйеге қарағанда күрделірек, бірақ конструкция мен жұмыс істеудің негізгі принциптері 1-суретте көрсетілгендерге ұқсас.

The instrumentation needed to perform capillary electrophoresis is relatively simple. A basic schematic of a capillary electrophoresis system is shown in figure 1. The system's main components are a sample vial, source and destination vials, a capillary, electrodes, a high voltage power supply, a detector, and a data output and handling device. The source vial, destination vial and capillary are filled with an electrolyte such as an aqueous buffer solution. To introduce the sample, the capillary inlet is placed into a vial containing the sample. Sample is introduced into the capillary via capillary action, pressure, siphoning, or electrokinetically, and the capillary is then returned to the source vial. The migration of the analytes is initiated by an electric field that is applied between the source and destination vials and is supplied to the electrodes by the high voltage power supply. In the most common mode of CE, all ions, positive or negative, are pulled through the capillary in the same direction by electroosmotic flow. The analytes separate as they migrate due to their electrophoretic mobility, and are detected near the outlet end of the capillary. The output of the detector is sent to a data output and handling device such as an integrator or computer. The data is then displayed as an electropherogram, which reports detector response as a function of time. Separated chemical compounds appear as peaks with different migration times in an electropherogram. The technique is often attributed to James W. Jorgensen and Krynn DeArman Lukacs, who first demonstrated the capabilities of this technique. Capillary electrophoresis was first combined with mass spectrometry by Richard D. Smith and coworkers, and provides extremely high sensitivity for the analysis of very small sample sizes. Despite the very small sample sizes (typically only a few nanoliters of liquid are introduced into the capillary), high sensitivity and sharp peaks are achieved in part due to injection strategies that result in a concentration of analytes into a narrow zone near the inlet of the capillary. This is achieved in either pressure or electrokinetic injections simply by suspending the sample in a buffer of lower conductivity (e. g. lower salt concentration) than the running buffer. A process called field amplified sample stacking (a form of isotachophoresis) results in concentration of analyte in a narrow zone at the boundary between the low conductivity sample and the higher conductivity running buffer. To achieve greater sample throughput, instruments with arrays of capillaries are used to analyze many samples simultaneously. Such capillary array electrophoresis (CAE) instruments with 16 or 96 capillaries are used for medium to high throughput capillary DNA sequencing, and the inlet ends of the capillaries are arrayed spatially to accept samples directly from SBS standard footprint 96 well plates. Certain aspects of the instrumentation (such as detection) are necessarily more complex than for a single capillary system, but the fundamental principles of design and operation are similar to those shown in Figure 1.

Анықтау

Капиллярлық электрофорез арқылы бөлінуді бірнеше детекторлық құрылғылар арқылы анықтауға болады. Көптеген коммерциялық жүйелер UV немесе UV-Vis сіңіруін негізгі анықтау режимі ретінде пайдаланады. Бұл жүйелерде капиллярдың бір бөлігі детекторлық жасуша ретінде қолданылады. Түтікшедегі анықтау ажыратылған аналиттерді ажырату қабілетін жоғалтпай анықтауға мүмкіндік береді. Жалпы, капиллярлық электрофорезде қолданылатын капиллярлар полимермен (көбінесе полиимидпен немесе тефлонмен) жабылады, бұл олардың икемділігін арттырады. Дегенмен, UV анықтау үшін қолданылатын капиллярдың бөлігі оптикалық тұрғыдан мөлдір болуы керек. Полиимидпен қапталған капиллярлар үшін қаптаманың бір бөлігі әдетте бірнеше миллиметрлік ашық терезе жасау үшін күйдіріледі немесе сызылады. Капиллярдың бұл ашық бөлігі оңай сынуы мүмкін, сондықтан жасуша терезесінің тұрақтылығын арттыру үшін мөлдір қаптамасы бар капиллярлар қол жетімді. Капиллярлық электрофорездегі детекторлық жасушаның жол ұзындығы (~50 микрометр) дәстүрлі UV жасушасынан (~1 см) әлдеқайда қысқа. Beer-Lambert заңына сәйкес, детектордың сезімталдығы жасушаның жол ұзындығына пропорционалды. Сезімталдықты арттыру үшін жол ұзындығын ұлғайтуға болады, бірақ бұл ажыратымдылықтың төмендеуіне әкеледі. Капиллярлық түтікшені анықтау нүктесінде кеңейтіп, ұзын жолды "көпіршікті жасуша" жасауға болады немесе 2-суретте көрсетілгендей анықтау нүктесінде қосымша түтікшелер қосуға болады. Алайда, екі әдіс те бөлінудің ажыратымдылығын төмендетеді. Егер капилляр қабырғасында жылыту және қысыммен тегіс аневризма жасалса, бұл төмендеу байқалмайды, себебі ағын сақталады. Гари Гордонның бұл өнертабысы, АҚШ патенты 5061361, сіңіру жолының ұзындығын әдетте үш есеге арттырады. UV сіңіру детектормен қолданылғанда, жасушадағы аналиттің кең қимасы жарық сәулесін екі есеге дейін арттырады, бұл ату шуын екі есеге азайтады. Бұл екі фактордың бірігіп, Agilent Technologies компаниясының Bubble Cell CE детекторының сезімталдығын тікелей капиллярды пайдаланғанға қарағанда алты есеге арттырады. Бұл жасуша мен оның өндірісі Hewlett Packard Journal журналының 1995 жылғы маусым айындағы 62-бетінде сипатталған. [[Файл:Extendedpathlength.gif|frame|2-сурет: Капиллярдың жол ұзындығын арттыру техникалары: а) көпіршікті жасуша және б) z-жасуша (қосымша түтікшелер). Үлгі компоненттерінің сәйкестігін анықтау үшін капиллярлық электрофорез массалық спектрометрлермен немесе беттік күшейтілген Раман спектроскопиясымен (SERS) тікелей байланыстырылуы мүмкін. Көптеген жүйелерде капиллярдың шығысы электроспрей иондауын (ESI) пайдаланатын ион көзіне енгізіледі. Нәтижедегі иондар массалық спектрометрмен талданады. Бұл орнату тұрақсыз буферлік ерітінділерді қажет етеді, бұл қолданылуы мүмкін бөлу режимдерінің ауқымына және қол жеткізілетін ажыратымдылық деңгейіне әсер етеді.

Separation by capillary electrophoresis can be detected by several detection devices. The majority of commercial systems use UV or UV Vis absorbance as their primary mode of detection. In these systems, a section of the capillary itself is used as the detection cell. The use of on tube detection enables detection of separated analytes with no loss of resolution. In general, capillaries used in capillary electrophoresis are coated with a polymer (frequently polyimide or Teflon) for increased flexibility. The portion of the capillary used for UV detection, however, must be optically transparent. For polyimide coated capillaries, a segment of the coating is typically burned or scraped off to provide a bare window several millimeters long. This bare section of capillary can break easily, and capillaries with transparent coatings are available to increase the stability of the cell window. The path length of the detection cell in capillary electrophoresis (~ 50 micrometers) is far less than that of a traditional UV cell (~ 1 cm). According to the Beer Lambert law, the sensitivity of the detector is proportional to the path length of the cell. To improve the sensitivity, the path length can be increased, though this results in a loss of resolution. The capillary tube itself can be expanded at the detection point, creating a "bubble cell" with a longer path length or additional tubing can be added at the detection point as shown in figure 2. Both of these methods, however, will decrease the resolution of the separation. This decrease is almost unnoticeable if a smooth aneurysm is produced in the wall of a capillary by heating and pressurization, as plug flow can be preserved. This invention by Gary Gordon, US Patent 5061361, typically triples the absorbance path length. When used with a UV absorbance detector, the wider cross section of the analyte in the cell allows for an illuminating beam twice as large, which reduces shot noise by a factor of two. Together these two factors increase the sensitivity of Agilent Technologies's Bubble Cell CE Detector six times over that of one using a straight capillary. This cell and its manufacture are described on page 62 of the June 1995 issue of the Hewlett Packard Journal. [[File:Extendedpathlength. gif|frame|Figure 2: Techniques for increasing the pathlength of the capillary: a) a bubble cell and b) a z cell (additional tubing). In order to obtain the identity of sample components, capillary electrophoresis can be directly coupled with mass spectrometers or surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In most systems, the capillary outlet is introduced into an ion source that utilizes electrospray ionization (ESI). The resulting ions are then analyzed by the mass spectrometer. This setup requires volatile buffer solutions, which will affect the range of separation modes that can be employed and the degree of resolution that can be achieved.

Қолданбалар

Слюнадағы NH4+, Na+, K+, Mg2+ және Ca2+ иондарын бір мезгілде анықтау үшін капиллярлық электрофорез қолданылуы мүмкін. Сот медицинасында капиллярлық электрофорездің (КЭ) негізгі қолданыстарының бірі – полимераза тізбекті реакция (ПТР) арқылы ДНК фрагменттерін күшейту және анықтау әдістерін әзірлеу, бұл сот медицинасында ДНК талдауының жылдам және маңызды жетістіктеріне әкелді. ДНК-ны бөлу сырғалау буферімен толтырылған, 50 мм-лік, жіңішке CE кремний капилляры арқылы жүргізіледі. Бұл капиллярлар жылуды таратуға өте жақсы қабілетті, плита гель электрофорезіне қарағанда электр өрісінің күшін әлдеқайда жоғары қолдануға мүмкіндік береді. Сондықтан капиллярлардағы бөліну жылдам және тиімді. Сонымен қатар, капиллярларды тиімді және автоматтандырылған инъекциялар үшін оңай толтыруға және ауыстыруға болады. Анықтама капиллярға жасалған терезе арқылы флуоресценция арқылы жүзеге асырылады. Бір капиллярлы және капиллярлық массивті құрылғылар қолжетімді, массивті жүйелер бір мезгілде 16 немесе одан да көп сынаманы өңдеуге қабілетті, бұл өнімділікті арттырады. Сот биологтары КЭ-ді негізгі түрде биологиялық үлгілерден STR-ді анықтау үшін қолданады, бұл жеке адамдар арасында ерекшеленетін жоғары полиморфты генетикалық маркерлерден профильді құруға мүмкіндік береді. КЭ-нің басқа да қолданыстарына сот-медициналық үлгілердің биологиялық сұйықтығының немесе тінінің шығу тегін анықтауға көмектесетін нақты мРНҚ фрагменттерін анықтау кіреді. КЭ-нің тағы бір қолданылуы – сия талдауы, онда сиялы принтерлермен басылған құжаттардың жалғандалу жиілігінің артуына байланысты сиялы принтерлердің сиясын талдау қажеттілігі артып келеді. Сияның химиялық құрамы жалған құжаттар мен жалған банкноттарды анықтауда маңызды ақпаратты ұсынады. Мицеллярлық электрофоретикалық капиллярлық хроматография (МЭКК) қағаздан алынған сияларды талдау үшін әзірленді және қолданылды. Оның жоғары ажыратымдылығы, әсіресе бірнеше химиялық тұрғыдан ұқсас заттарды қамтитын сияларға қатысты, бір өндірушіден алынған сиялар арасындағы айырмашылықтарды да анықтауға мүмкіндік береді. Бұл оны сияның химиялық құрамына негізделген құжаттардың шығу тегін бағалау үшін қолайлы етеді. Бір картридждің әртүрлі принтер үлгілерімен үйлесімді болуы мүмкін екенін ескере отырып, сияны МЭКК электрофоретикалық профильдері бойынша ажырату, бастапқы принтер үлгісінен гөрі бастапқы сия картриджін (оның өндірушісі мен картридж нөмірін) анықтаудың сенімді әдісі болып табылады. Капиллярлық электрофорездің (КЭ) арнайы түрі – аффиниттік капиллярлық электрофорез (АКЭ) – ақуыз-лиганд өзара әрекеттесуін түсіну үшін молекулааралық байланыс әрекеттесуін пайдаланады. Фармацевтикалық компаниялар АКЭ-ні көптеген себептермен қолданады, олардың бірі – дәрі-дәрмектер мен лигандтар немесе дәрі-дәрмектер мен мицеллалар сияқты белгілі бір тасымалдаушы жүйелер үшін байланысу тұрақтыларын анықтау. Бұл әдіс қарапайымдылығы, жылдам нәтижелері және аз мөлшерде аналит қолдануы себепті кеңінен қолданылады. АКЭ қолдану аналиттерді байланыстыру, бөлу және анықтау туралы нақты мәліметтерді ұсынуы мүмкін және ол өмір ғылымдарындағы зерттеулер үшін өте практикалық болып табылады. Аптамерге негізделген аффиниттік капиллярлық электрофорез арнайы аффиниттік реагенттерді талдау және өзгерту үшін қолданылады. Өзгертілген аптамерлер жоғары байланысу аффинділігін, спецификалық қабілетін және нуклеазаға төзімділігін көрсетеді. Рен және авторлар. IL 1α мен аптамер арасындағы гидрофобтық және полярлық өзара әрекеттесулерден жаңа конформациялық ерекшеліктер мен жоғары аффиндік өзара әрекеттесулерді енгізу үшін аптамерлерге модификацияланған нуклеотидтерді енгізді. Хуан және авторлар. Аптамерлерді қолдана отырып, белок-белок өзара әрекеттесуін зерттеу үшін АКЭ-ні қолданды. α-тромбинге байланысатын аптамер 6-карбоксифлуоресцеинмен белгіленді, селективті флуоресценттік зонд ретінде қолданылды және белок-белок және белок-ДНК өзара әрекеттесулерінің байланысу орындары туралы ақпаратты анықтау үшін зерттелді. Капиллярлық электрофорез (КЭ) ДНК тізбектеудің маңызды және тиімді әдісіне айналды, ол жоғары өнімділік пен жоғары дәлдікті тізбектеу ақпаратын ұсынады. Вулли және Матис КЭ чипін ДНК фрагменттерін 97% дәлдікпен және 540 секунд ішінде 150 негіз жылдамдығымен тізбектеу үшін қолданды. Олар флуоресценттік деректерді жинау үшін 4 түсті таңбалау және анықтау форматын қолданды. Нуклеин қышқылы тізбегінің әр бөлігінің – A, T, C және G – концентрациясын анықтау үшін флуоресценция қолданылады, ал анықтаудан алынған концентрациялық шыңдар ДНК тізбегін анықтау үшін қолданылады.

Capillary electrophoresis may be used for the simultaneous determination of the ions NH4+,, Na+, K+, Mg2+ and Ca2+ in saliva. One of the main applications of CE in forensic science is the development of methods for amplification and detection of DNA fragments using polymerase chain reaction (PCR), which has led to rapid and dramatic advances in forensic DNA analysis. DNA separations are carried out using thin CE 50 mm fused silica capillaries filled with a sieving buffer. These capillaries have excellent capabilities to dissipate heat, permitting much higher electric field strengths to be used than slab gel electrophoresis. Therefore separations in capillaries are rapid and efficient. Additionally, the capillaries can be easily refilled and changed for efficient and automated injections. Detection occurs via fluorescence through a window etched in the capillary. Both single capillary and capillary array instruments are available with array systems capable of running 16 or more samples simultaneously for increased throughput. A major use of CE by forensic biologists is typing of STR from biological samples to generate a profile from highly polymorphic genetic markers which differ between individuals. Other emerging uses for CE include the detection of specific mRNA fragments to help identify the biological fluid or tissue origin of a forensic sample. Another application of CE in forensics is ink analysis, where the analysis of inkjet printing inks is becoming more necessary due to increasingly frequent counterfeiting of documents printed by inkjet printers. The chemical composition of inks provides very important information in cases of fraudulent documents and counterfeit banknotes. Micellar electrophoretic capillary chromatography (MECC) has been developed and applied to the analysis of inks extracted from paper. Due to its high resolving power relative to inks containing several chemically similar substances, differences between inks from the same manufacturer can also be distinguished. This makes it suitable for evaluating the origin of documents based on the chemical composition of inks. It is worth noting that because of the possible compatibility of the same cartridge with different printer models, the differentiation of inks on the basis of their MECC electrophoretic profiles is a more reliable method for the determination of the ink cartridge of origin (its producer and cartridge number) rather than the printer model of origin. A specialized type of CE, affinity capillary electrophoresis (ACE), utilizes intermolecular binding interactions to understand protein ligand interactions. Pharmaceutical companies use ACE for a multitude of reasons, with one of the main ones being the association/binding constants for drugs and ligands or drugs and certain vehicle systems like micelles. It is a widely used technique because of its simplicity, rapid results, and low analyte usage. The use of ACE can provide specific details in binding, separation, and detection of analytes and is proven to be highly practical for studies in life sciences. Aptamer based affinity capillary electrophoresis is utilized for the analysis and modifications of specific affinity reagents. Modified aptamers ideally exhibit and high binding affinity, specificity, and nuclease resistance. Ren et al. incorporated modified nucleotides in aptamers to introduce new confrontational features and high affinity interactions from the hydrophobic and polar interactions between IL 1α and the aptamer. Huang et al. uses ACE to investigate protein protein interactions using aptamers. A α thrombin binding aptamer was labeled with 6 carboxyfluorescein for use as a selective fluorescent probe and was studied to elucidate information on binding sites for protein protein and protein DNA interactions. Capillary electrophoresis (CE) has become an important, cost effective approach to do DNA sequencing that provides high throughput and high accuracy sequencing information. Woolley and Mathies used a CE chip to sequence DNA fragments with 97% accuracy and a speed of 150 bases in 540 seconds. They used a 4 color labeling and detection format to collect fluorescent data. Fluorescence is used to view the concentrations of each part of the nucleic acid sequence, A, T, C and G, and these concentration peaks that are graphed from the detection are used to determine the sequence of the DNA.