Капиллярный электрофорез: метод разделения химических и биологических образцов.

Введение

Метод разделения химических или биологических образцов

Капиллярный электрофорез (CE) – это семейство электрокинетических методов разделения, выполняемых в капиллярах субмиллиметрового диаметра и в микро- и нанофлюидных каналах. Зачастую под CE понимают электрофорез капиллярной зоны (CZE), однако другие электрофоретические методы, такие как электрофорез в капиллярном геле (CGE), капиллярная изоэлектрическая фокусировка (CIEF), капиллярная изотахофорезия и мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC), также относятся к этому классу методов. В методах CE аналиты перемещаются через растворы электролита под действием электрического поля. Разделение аналитов может происходить на основе ионной подвижности и/или распределения между альтернатными фазами посредством нековалентных взаимодействий. Кроме того, аналиты могут быть концентрированы или "сфокусированы" с помощью градиентов проводимости и pH.

Инструментовка

Приборы, необходимые для проведения капиллярного электрофореза, относительно просты. На рисунке 1 представлена основная схема капиллярной электрофорезной системы. Основными компонентами системы являются проба, исходный и конечный сосуды, капилляр, электроды, источник высокого напряжения, детектор и устройство вывода и обработки данных. Исходный и конечный сосуды, а также капилляр заполняются электролитом, например, водным буферным раствором. Для введения пробы вход капилляра помещают в сосуд, содержащий пробу. Проба вводится в капилляр за счет капиллярного действия, давления, сифонного эффекта или электрокинетически, после чего капилляр возвращают в исходный сосуд. Миграция аналитов инициируется электрическим полем, которое прикладывается между исходным и конечным сосудами и подается на электроды от источника высокого напряжения. В наиболее распространенном режиме капиллярного электрофореза все ионы, положительные или отрицательные, перемещаются через капилляр в одном направлении под действием электроосмотического потока. Аналиты разделяются по мере миграции в зависимости от их электрофоретической подвижности и детектируются вблизи выходного конца капилляра. Сигнал детектора поступает на устройство вывода и обработки данных, такое как интегратор или компьютер. Данные затем отображаются в виде электроферограммы, которая показывает реакцию детектора как функцию времени. Разделенные химические соединения отображаются в виде пиков с различными временами миграции на электроферограмме. Эта техника часто приписывается Джеймсу У. Йоргенсену и Кринн ДеАрман Лукакс, которые впервые продемонстрировали возможности данного метода. Ричард Д. Смит и его коллеги впервые объединили капиллярный электрофорез с масс-спектрометрией, что обеспечивает чрезвычайно высокую чувствительность при анализе очень малых объемов проб. Несмотря на очень малые объемы проб (обычно в капилляр вводят всего несколько нанолитров жидкости), высокая чувствительность и четкие пики достигаются отчасти благодаря стратегиям введения пробы, которые приводят к концентрации аналитов в узкой зоне вблизи входа в капилляр. Это достигается при введении пробы под давлением или электрокинетически путем суспендирования пробы в буфере с более низкой проводимостью (например, более низкой концентрацией соли), чем у рабочего буфера. Процесс, называемый усилением концентрации пробы в электрическом поле (форма изотахофореза), приводит к концентрации аналита в узкой зоне на границе между пробой с низкой проводимостью и рабочим буфером с высокой проводимостью. Для увеличения производительности используются приборы с массивами капилляров, позволяющие анализировать множество проб одновременно. Такие приборы капиллярного электрофореза с массивом капилляров (CAE) с 16 или 96 капиллярами используются для секвенирования ДНК с средней и высокой производительностью, а входные концы капилляров расположены пространственно для непосредственного приема проб из 96-луночных планшет SBS стандартного формата. Некоторые аспекты приборов (например, детектирование) неизбежно более сложны, чем для системы с одним капилляром, но основные принципы конструкции и работы аналогичны тем, что показаны на рисунке 1.

The instrumentation needed to perform capillary electrophoresis is relatively simple. A basic schematic of a capillary electrophoresis system is shown in figure 1. The system's main components are a sample vial, source and destination vials, a capillary, electrodes, a high voltage power supply, a detector, and a data output and handling device. The source vial, destination vial and capillary are filled with an electrolyte such as an aqueous buffer solution. To introduce the sample, the capillary inlet is placed into a vial containing the sample. Sample is introduced into the capillary via capillary action, pressure, siphoning, or electrokinetically, and the capillary is then returned to the source vial. The migration of the analytes is initiated by an electric field that is applied between the source and destination vials and is supplied to the electrodes by the high voltage power supply. In the most common mode of CE, all ions, positive or negative, are pulled through the capillary in the same direction by electroosmotic flow. The analytes separate as they migrate due to their electrophoretic mobility, and are detected near the outlet end of the capillary. The output of the detector is sent to a data output and handling device such as an integrator or computer. The data is then displayed as an electropherogram, which reports detector response as a function of time. Separated chemical compounds appear as peaks with different migration times in an electropherogram. The technique is often attributed to James W. Jorgensen and Krynn DeArman Lukacs, who first demonstrated the capabilities of this technique. Capillary electrophoresis was first combined with mass spectrometry by Richard D. Smith and coworkers, and provides extremely high sensitivity for the analysis of very small sample sizes. Despite the very small sample sizes (typically only a few nanoliters of liquid are introduced into the capillary), high sensitivity and sharp peaks are achieved in part due to injection strategies that result in a concentration of analytes into a narrow zone near the inlet of the capillary. This is achieved in either pressure or electrokinetic injections simply by suspending the sample in a buffer of lower conductivity (e. g. lower salt concentration) than the running buffer. A process called field amplified sample stacking (a form of isotachophoresis) results in concentration of analyte in a narrow zone at the boundary between the low conductivity sample and the higher conductivity running buffer. To achieve greater sample throughput, instruments with arrays of capillaries are used to analyze many samples simultaneously. Such capillary array electrophoresis (CAE) instruments with 16 or 96 capillaries are used for medium to high throughput capillary DNA sequencing, and the inlet ends of the capillaries are arrayed spatially to accept samples directly from SBS standard footprint 96 well plates. Certain aspects of the instrumentation (such as detection) are necessarily more complex than for a single capillary system, but the fundamental principles of design and operation are similar to those shown in Figure 1.

Обнаружение

Разделение с помощью капиллярного электрофореза может быть зарегистрировано несколькими детекторами. Большинство коммерческих систем используют УФ- или УФ-видимое поглощение в качестве основного метода детектирования. В этих системах часть самого капилляра используется в качестве детекционной ячейки. Использование внутритрубного детектирования позволяет регистрировать разделенные аналиты без потери разрешения. Как правило, капилляры, используемые в капиллярном электрофорезе, покрыты полимером (часто полиимидом или тефлоном) для повышения гибкости. Однако участок капилляра, используемый для УФ-детектирования, должен быть оптически прозрачным. Для капилляров с полиимидным покрытием обычно выжигают или соскабливают сегмент покрытия, чтобы создать незащищенное окно длиной в несколько миллиметров. Этот незащищенный участок капилляра может легко сломаться, поэтому доступны капилляры с прозрачным покрытием для повышения стабильности ячейки. Длина оптического пути в детекционной ячейке капиллярного электрофореза (~ 50 микрометров) значительно меньше, чем у традиционной УФ-ячейки (~ 1 см). Согласно закону Бера-Ламберта, чувствительность детектора пропорциональна длине оптического пути ячейки. Для повышения чувствительности длину оптического пути можно увеличить, однако это приводит к потере разрешения. Сам капилляр можно расширить в точке детектирования, создавая «пузырьковую ячейку» с большей длиной оптического пути, или добавить дополнительную трубку в точке детектирования, как показано на рисунке 2. Оба этих метода, однако, снижают разрешение разделения. Это снижение почти незаметно, если в стенке капилляра создается гладкая аневризма путем нагрева и создания давления, поскольку можно сохранить проточный режим. Это изобретение Гэри Гордона, патент США 5061361, обычно утраивает длину оптического пути поглощения. При использовании с УФ-детектором более широкое поперечное сечение аналита в ячейке позволяет использовать в два раза больший освещающий луч, что снижает дробовой шум в два раза. Вместе эти два фактора увеличивают чувствительность детектора пузырьковых ячеек Agilent Technologies в шесть раз по сравнению с детектором, использующим прямой капилляр. Эта ячейка и ее изготовление описаны на странице 62 июньского выпуска Hewlett Packard Journal за 1995 год. [[Файл:Extendedpathlength.gif|frame|Рисунок 2: Методы увеличения длины оптического пути капилляра: а) пузырьковая ячейка и б) z-ячейка (дополнительная трубка). Для определения состава компонентов пробы капиллярный электрофорез может быть напрямую соединен с масс-спектрометрами или спектроскопией поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (SERS). В большинстве систем выход капилляра вводят в ионный источник, использующий электрораспылительную ионизацию (ESI). Полученные ионы затем анализируются масс-спектрометром. Для такой установки требуются летучие буферные растворы, что повлияет на диапазон применимых методов разделения и достижимую степень разрешения.

Separation by capillary electrophoresis can be detected by several detection devices. The majority of commercial systems use UV or UV Vis absorbance as their primary mode of detection. In these systems, a section of the capillary itself is used as the detection cell. The use of on tube detection enables detection of separated analytes with no loss of resolution. In general, capillaries used in capillary electrophoresis are coated with a polymer (frequently polyimide or Teflon) for increased flexibility. The portion of the capillary used for UV detection, however, must be optically transparent. For polyimide coated capillaries, a segment of the coating is typically burned or scraped off to provide a bare window several millimeters long. This bare section of capillary can break easily, and capillaries with transparent coatings are available to increase the stability of the cell window. The path length of the detection cell in capillary electrophoresis (~ 50 micrometers) is far less than that of a traditional UV cell (~ 1 cm). According to the Beer Lambert law, the sensitivity of the detector is proportional to the path length of the cell. To improve the sensitivity, the path length can be increased, though this results in a loss of resolution. The capillary tube itself can be expanded at the detection point, creating a "bubble cell" with a longer path length or additional tubing can be added at the detection point as shown in figure 2. Both of these methods, however, will decrease the resolution of the separation. This decrease is almost unnoticeable if a smooth aneurysm is produced in the wall of a capillary by heating and pressurization, as plug flow can be preserved. This invention by Gary Gordon, US Patent 5061361, typically triples the absorbance path length. When used with a UV absorbance detector, the wider cross section of the analyte in the cell allows for an illuminating beam twice as large, which reduces shot noise by a factor of two. Together these two factors increase the sensitivity of Agilent Technologies's Bubble Cell CE Detector six times over that of one using a straight capillary. This cell and its manufacture are described on page 62 of the June 1995 issue of the Hewlett Packard Journal. [[File:Extendedpathlength. gif|frame|Figure 2: Techniques for increasing the pathlength of the capillary: a) a bubble cell and b) a z cell (additional tubing). In order to obtain the identity of sample components, capillary electrophoresis can be directly coupled with mass spectrometers or surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In most systems, the capillary outlet is introduced into an ion source that utilizes electrospray ionization (ESI). The resulting ions are then analyzed by the mass spectrometer. This setup requires volatile buffer solutions, which will affect the range of separation modes that can be employed and the degree of resolution that can be achieved.

Приложения

Капилярный электрофорез может использоваться для одновременного определения ионов NH4+, Na+, K+, Mg2+ и Ca2+ в слюне. Одно из основных применений КЭ в судебной науке – разработка методов амплификации и обнаружения фрагментов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), что привело к быстрому и значительному прогрессу в судебно-медицинском анализе ДНК. Разделение ДНК осуществляется с использованием тонких капилляров из плавленого кварца CE 50 мм, заполненных ситовым буфером. Эти капилляры обладают отличной теплоотдачей, позволяющей использовать значительно более высокие напряжения электрического поля, чем при электрофорезе в геле. Следовательно, разделение в капиллярах происходит быстро и эффективно. Кроме того, капилляры можно легко повторно заполнять и заменять для эффективных и автоматизированных инъекций. Детектирование происходит посредством флуоресценции через окно, вытравленное в капилляре. Доступны как однокапиллярные, так и капиллярные массивы, причем массивные системы способны одновременно обрабатывать 16 и более образцов для повышения производительности. Основное применение КЭ судебными биологами – типирование STR из биологических образцов для создания профиля на основе высокополиморфных генетических маркеров, различающихся у разных индивидуумов. Другие перспективные области применения КЭ включают обнаружение специфических фрагментов мРНК для определения биологического происхождения жидкости или ткани судебно-медицинского образца. Еще одно применение КЭ в криминалистике – анализ чернил, в частности, анализ чернил для струйной печати, который становится все более важным из-за растущего числа подделок документов, напечатанных на струйных принтерах. Химический состав чернил предоставляет важную информацию при расследовании случаев поддельных документов и фальшивых банкнот. Мицеллярная электрофоретическая капиллярная хроматография (МЭКХ) была разработана и применяется для анализа чернил, извлеченных из бумаги. Благодаря высокой разрешающей способности по отношению к чернилам, содержащим несколько химически схожих веществ, можно различить даже чернила от одного и того же производителя. Это делает ее подходящей для оценки происхождения документов на основе химического состава чернил. Важно отметить, что из-за возможной совместимости одного и того же картриджа с различными моделями принтеров, дифференциация чернил на основе их электрофоретических профилей МЭКХ является более надежным методом определения картриджа происхождения чернил (его производителя и номера), чем определение модели принтера. Специализированный тип КЭ, аффинный капиллярный электрофорез (АКЭ), использует межмолекулярные взаимодействия для изучения взаимодействий лиганда с белком. Фармацевтические компании используют АКЭ по множеству причин, одной из основных является определение констант ассоциации/связывания лекарств с лигандами или лекарств с определенными системами доставки, такими как мицеллы. Это широко используемый метод благодаря своей простоте, быстроте получения результатов и низкому расходу анализируемого вещества. Использование АКЭ позволяет получить конкретные данные о связывании, разделении и обнаружении аналитов и доказало свою высокую практичность для исследований в области наук о жизни. Аффинный капиллярный электрофорез на основе аптамеров используется для анализа и модификации специфических аффинных реагентов. Модифицированные аптамеры в идеале демонстрируют высокую аффинность связывания, специфичность и устойчивость к нуклеазам. Рен и соавторы включили модифицированные нуклеотиды в аптамеры для введения новых конформационных особенностей и высокоаффинных взаимодействий, основанных на гидрофобных и полярных взаимодействиях между IL 1α и аптамером. Хуан и соавторы используют АКЭ для изучения взаимодействий белок-белок с использованием аптамеров. Аптамер, связывающий α-тромбин, был мечен 6-карбоксифлуоресцеином для использования в качестве селективного флуоресцентного зонда и изучался для получения информации о местах связывания белок-белок и белок-ДНК. Капилярный электрофорез (КЭ) стал важным и экономически эффективным методом секвенирования ДНК, обеспечивающим высокую пропускную способность и высокую точность информации о секвенировании. Вулли и Мэтис использовали чип КЭ для секвенирования фрагментов ДНК с точностью 97% и скоростью 150 оснований за 540 секунд. Они использовали 4-цветную маркировку и формат детекции для сбора флуоресцентных данных. Флуоресценция используется для определения концентрации каждой части последовательности нуклеиновой кислоты – A, T, C и G, а пики концентраций, полученные при детекции, используются для определения последовательности ДНК.

Capillary electrophoresis may be used for the simultaneous determination of the ions NH4+,, Na+, K+, Mg2+ and Ca2+ in saliva. One of the main applications of CE in forensic science is the development of methods for amplification and detection of DNA fragments using polymerase chain reaction (PCR), which has led to rapid and dramatic advances in forensic DNA analysis. DNA separations are carried out using thin CE 50 mm fused silica capillaries filled with a sieving buffer. These capillaries have excellent capabilities to dissipate heat, permitting much higher electric field strengths to be used than slab gel electrophoresis. Therefore separations in capillaries are rapid and efficient. Additionally, the capillaries can be easily refilled and changed for efficient and automated injections. Detection occurs via fluorescence through a window etched in the capillary. Both single capillary and capillary array instruments are available with array systems capable of running 16 or more samples simultaneously for increased throughput. A major use of CE by forensic biologists is typing of STR from biological samples to generate a profile from highly polymorphic genetic markers which differ between individuals. Other emerging uses for CE include the detection of specific mRNA fragments to help identify the biological fluid or tissue origin of a forensic sample. Another application of CE in forensics is ink analysis, where the analysis of inkjet printing inks is becoming more necessary due to increasingly frequent counterfeiting of documents printed by inkjet printers. The chemical composition of inks provides very important information in cases of fraudulent documents and counterfeit banknotes. Micellar electrophoretic capillary chromatography (MECC) has been developed and applied to the analysis of inks extracted from paper. Due to its high resolving power relative to inks containing several chemically similar substances, differences between inks from the same manufacturer can also be distinguished. This makes it suitable for evaluating the origin of documents based on the chemical composition of inks. It is worth noting that because of the possible compatibility of the same cartridge with different printer models, the differentiation of inks on the basis of their MECC electrophoretic profiles is a more reliable method for the determination of the ink cartridge of origin (its producer and cartridge number) rather than the printer model of origin. A specialized type of CE, affinity capillary electrophoresis (ACE), utilizes intermolecular binding interactions to understand protein ligand interactions. Pharmaceutical companies use ACE for a multitude of reasons, with one of the main ones being the association/binding constants for drugs and ligands or drugs and certain vehicle systems like micelles. It is a widely used technique because of its simplicity, rapid results, and low analyte usage. The use of ACE can provide specific details in binding, separation, and detection of analytes and is proven to be highly practical for studies in life sciences. Aptamer based affinity capillary electrophoresis is utilized for the analysis and modifications of specific affinity reagents. Modified aptamers ideally exhibit and high binding affinity, specificity, and nuclease resistance. Ren et al. incorporated modified nucleotides in aptamers to introduce new confrontational features and high affinity interactions from the hydrophobic and polar interactions between IL 1α and the aptamer. Huang et al. uses ACE to investigate protein protein interactions using aptamers. A α thrombin binding aptamer was labeled with 6 carboxyfluorescein for use as a selective fluorescent probe and was studied to elucidate information on binding sites for protein protein and protein DNA interactions. Capillary electrophoresis (CE) has become an important, cost effective approach to do DNA sequencing that provides high throughput and high accuracy sequencing information. Woolley and Mathies used a CE chip to sequence DNA fragments with 97% accuracy and a speed of 150 bases in 540 seconds. They used a 4 color labeling and detection format to collect fluorescent data. Fluorescence is used to view the concentrations of each part of the nucleic acid sequence, A, T, C and G, and these concentration peaks that are graphed from the detection are used to determine the sequence of the DNA.