Зимография – ферменттердің субстрат спектріне негізделген гидролиздік ферменттерді анықтауға арналған электрофоретикалық техника. Зимографияның үш түрі қолданылады: гельдік зимография, in situ зимография және in vivo зимография. Мысалы, полиакриламид гельге енгізілген желатин, гель арқылы өткен белсенді желатиназалармен ыдырайды. Кумасси бояуынан кейін ыдырау аймақтары, қараңғы боялған фонға қарсы мөлдір жолақтар түрінде көрінеді. Зимография терминінің қазіргі қолданысы, көбінесе белгілі бір сыра қайнатушылар немесе шарапшылар тарапынан, немесе ашытудың нақты бір түрінде, мысалы, ашытқының белгілі бір штаммымен немесе бактериялардың түрімен ашытылған өнімдерді зерттеу және тізімдеу үшін бейімделген. Зимография сондай-ақ, жұмыс жиынтығы ретінде қарастырылатын ашытылған өнімдердің жиынтығын да білдіреді. Мысалы, нақты бір сыра зауытында өндірілген барлық сыраны бірлесіп оның зимографиясы деп атауға болады. Сондай-ақ, зимологияны немесе зимографияның қолданбалы ғылымын қараңыз. Зимология ашытудың биохимиялық процестеріне, әсіресе сыра қайнату, шарап жасау және басқа ашытылған тағамдарда ашытқы мен бактерияларды таңдауға қатысты. Мысалы, сыра жасау үшін жоғары (але) немесе төменгі ашытушы ашытқы (лагер) қолданылады, бұл сыраның қажетті сортының өндірілуін қамтамасыз етеді. Ашытқының синтезі сыраның дәмдік профиліне, яғни диацетилге (майлы, ысталған дәм немесе хош иіс) әсер етуі мүмкін.
Zymography is an electrophoretic technique for the detection of hydrolytic enzymes, based on the substrate repertoire of the enzyme. Three types of zymography are used; in gel zymography, in situ zymography and in vivo zymography. For instance, gelatin embedded in a polyacrylamide gel will be digested by active gelatinases run through the gel. After Coomassie staining, areas of degradation are visible as clear bands against a darkly stained background. Modern usage of the term zymography has been adapted to define the study and cataloging of fermented products, such as beer or wine, often by specific brewers or winemakers or within an identified category of fermentation such as with a particular strain of yeast or species of bacteria. Zymography also refers to a collection of related, fermented products, considered as a body of work. For example, all of the beers produced by a particular brewery could collectively be referred to as its zymography. See also Zymology or the applied science of zymography. Zymology relates to the biochemical processes of fermentation, especially the selection of fermenting yeast and bacteria in brewing, winemaking, and other fermented foods. For example, beer making involves the application of top (ale) or bottom fermenting yeast (lager), to produce the desired variety of beer. The synthesis of the yeast can impact the flavor profile of the beer, i. e. diacetyl (taste or aroma of buttery, butterscotch).
Гельдік зимография
Үлгілер стандартты, азайтылмаған SDS PAGE жүктеме буферінде дайындалады. Ферменттің қайта жиналуына кедергі келтіретін болғандықтан, тотығуға қарсы зат немесе қайнату қажет емес. Акриламид гельін дайындау кезінде еріту гельге қолайлы субстрат (мысалы, протеазаны анықтау үшін желатин немесе казеин) енгізіледі. Электрофорезден кейін SDS гельден (немесе зимограммадан) буферленбеген Triton X 100-мен инкубациялау арқылы алынып тасталады, содан кейін 37°C температурада белгілі бір уақыт бойы тиісті қоректік ортада инкубацияланады. Зимграмма кейіннен боялады (әдетте Amido Black немесе Coomassie көк түсімен), ал фермент субстратты ыдыратқан жерлердегі қараңғы фонға қарсы ашық жолақтар түрінде ас қорыту аймақтары көрінеді.
Samples are prepared in a standard, non reducing loading buffer for SDS PAGE. No reducing agent or boiling are necessary since these would interfere with refolding of the enzyme. A suitable substrate (e. g. gelatin or casein for protease detection) is embedded in the resolving gel during preparation of the acrylamide gel. Following electrophoresis, the SDS is removed from the gel (or zymogram) by incubation in unbuffered Triton X 100, followed by incubation in an appropriate digestion buffer, for an optimized length of time at 37 °C. The zymogram is subsequently stained (commonly with Amido Black or Coomassie brilliant blue), and areas of digestion appear as clear bands against a darkly stained background where the substrate has been degraded by the enzyme.
Стандартты протоколдағы өзгерістер
Стандартты протокол үлгі ферментіне байланысты өзгерістерді қажет етуі мүмкін; мысалы, D. melanogaster ас қорыту гликозидазалары көбінесе тотығу ортасында (яғни 2-меркаптоэтанол немесе DTT) және белгілі бір деңгейде қыздыру кезінде сақталады. Шындығында, 50°C-қа дейін қыздырудан кейін бөлінулер белсенділіктің айтарлықтай жоғалмауымен бірге жолақтардың айқын ажыратылуын көрсетеді. Бұрын α-амилаза белсенділігінің зимографиясы үшін қолданылған кең таралған протокол – В.В. Доанның «крахмал пленкасы» деп аталатын әдісі. Бұл әдісте гомогенаттағы белоктарды бөлу үшін PAGE гелі қолданылды. Содан кейін, крахмал ерітілген (немесе дұрысырақ айтқанда, суспензияланған) жұқа гель бастапқы гельдің үстіне белгілі бір уақытқа жабылды. Крахмалға кейіннен Лугольдің йоды қосылды. Гель зимографиясы микроорганизмдер өндіретін ферменттерді анықтау және талдау үшін жиі қолданылады. Бұл стандартты протоколға өзгерістер енгізуге әкелді, мысалы, аралас субстратты зимография. Кері зимографияда субстрат пен фермент акриламидпен бірге кополимеризацияланады және фермент тежегішін анықтау үшін пайдалы. Бояудан кейін тежелу аймақтары ашық (немесе аз боялған) фонға қарағанда қара жолақтар түрінде көрінеді. Импринт әдісінде ферментің бөлінуі туасу электрофорезы арқылы жүзеге асырылады, ал гель өңделген агароздың үстіне салынады. Зимография ксиланазалар, липазалар және хитиназалар сияқты басқа ферменттерді зерттеу үшін де қолданылуы мүмкін.
The standard protocol may require modifications depending on the sample enzyme; for instance, D. melanogaster digestive glycosidases generally survive reducing conditions (i. e. the presence of 2 mercaptoethanol or DTT), and to an extent, heating. Indeed, the separations following heating to 50 °C tend to exhibit a substantial increase in band resolution, without appreciable loss of activity. A common protocol used in the past for zymography of α amylase activity was the so called starch film protocol of W. W. Doane. Here a native PAGE gel was run to separate the proteins in a homogenate. Subsequently, a thin gel with starch dissolved (or more properly, suspended) in it was overlaid for a period of time on top of the original gel. The starch was then stained with Lugol's iodine. Gel zymography is often used for the detection and analysis of enzymes produced by microorganisms. This has led to variations on the standard protocol e. g. mixed substrate zymography. Reverse zymography copolymerizes both the substrate and the enzyme with the acrylamide, and is useful for the demonstration of enzyme inhibitor activity. Following staining, areas of inhibition are visualized as dark bands against a clear (or lightly stained) background. In imprint technique, the enzyme is separated by native gel electrophoresis and the gel is laid on top of a substrate treated agarose. Zymography can also be applied to other types of enzymes, including xylanases, lipases and chitinases.