Зимография: электрофоретическое обнаружение гидролитических ферментов. Методы (в геле, in situ, in vivo) и применение в изучении ферментации (пиво, вино).
Зимография – это электрофоретический метод обнаружения гидролитических ферментов, основанный на спектре субстратов, с которыми работает фермент. Выделяют три типа зимографии: зимография в геле (in gel), зимография in situ и зимография in vivo. Например, желатин, внедренный в полиакриламидный гель, будет расщеплен активными желатиназами при электрофорезе. После окрашивания Комасси области деградации видны как светлые полосы на темном фоне. В современной практике термин "зимография" также используется для обозначения изучения и каталогизации ферментированных продуктов, таких как пиво или вино, часто конкретными пивоварами или виноделами, или в рамках определенной категории ферментации, например, с использованием определенного штамма дрожжей или вида бактерий. Зимография может также относиться к коллекции связанных ферментированных продуктов, рассматриваемых как совокупность работ. Например, все сорта пива, производимые конкретной пивоварней, могут коллективно называться её зимографией. См. также зимологию – прикладную науку, изучающую зимографию. Зимология связана с биохимическими процессами ферментации, особенно с отбором ферментирующих дрожжей и бактерий в пивоварении, виноделии и производстве других ферментированных продуктов. Например, при производстве пива используются дрожжи верхнего (эль) или нижнего брожения (лагер) для получения желаемого сорта. Синтез дрожжей может влиять на вкусоароматический профиль пива, например, на содержание диацетила (вкус или аромат сливочного масла, ириски).
Zymography is an electrophoretic technique for the detection of hydrolytic enzymes, based on the substrate repertoire of the enzyme. Three types of zymography are used; in gel zymography, in situ zymography and in vivo zymography. For instance, gelatin embedded in a polyacrylamide gel will be digested by active gelatinases run through the gel. After Coomassie staining, areas of degradation are visible as clear bands against a darkly stained background. Modern usage of the term zymography has been adapted to define the study and cataloging of fermented products, such as beer or wine, often by specific brewers or winemakers or within an identified category of fermentation such as with a particular strain of yeast or species of bacteria. Zymography also refers to a collection of related, fermented products, considered as a body of work. For example, all of the beers produced by a particular brewery could collectively be referred to as its zymography. See also Zymology or the applied science of zymography. Zymology relates to the biochemical processes of fermentation, especially the selection of fermenting yeast and bacteria in brewing, winemaking, and other fermented foods. For example, beer making involves the application of top (ale) or bottom fermenting yeast (lager), to produce the desired variety of beer. The synthesis of the yeast can impact the flavor profile of the beer, i. e. diacetyl (taste or aroma of buttery, butterscotch).
Гелевая зимография
Образцы готовят в стандартном буфере для SDS-PAGE без восстановителей. Восстановитель или кипячение не требуются, так как они помешают правильной сворачиванию фермента. Подходящий субстрат (например, желатин или казеин для обнаружения протеаз) внедряют в разделяющий гель во время приготовления акриламидного геля. После электрофореза SDS удаляют из геля (или зимограммы) путем инкубации в небуферизированном Triton X-100, а затем в соответствующем буфере для переваривания в течение оптимального времени при 37 °C. Зимограмму затем окрашивают (обычно Амидо Черным или Комассиевым синим), и области переваривания проявляются как светлые полосы на фоне темного окрашивания, где субстрат был деградирован ферментом.
Samples are prepared in a standard, non reducing loading buffer for SDS PAGE. No reducing agent or boiling are necessary since these would interfere with refolding of the enzyme. A suitable substrate (e. g. gelatin or casein for protease detection) is embedded in the resolving gel during preparation of the acrylamide gel. Following electrophoresis, the SDS is removed from the gel (or zymogram) by incubation in unbuffered Triton X 100, followed by incubation in an appropriate digestion buffer, for an optimized length of time at 37 °C. The zymogram is subsequently stained (commonly with Amido Black or Coomassie brilliant blue), and areas of digestion appear as clear bands against a darkly stained background where the substrate has been degraded by the enzyme.
Изменения в стандартном протоколе
Стандартный протокол может потребовать модификаций в зависимости от исследуемого фермента; например, пищеварительные гликозидазы *D. melanogaster* обычно сохраняют активность в восстановительных условиях (то есть в присутствии 2-меркаптоэтанола или DTT) и в некоторой степени при нагревании. Действительно, разделение после нагревания до 50 °C часто демонстрирует существенное увеличение разрешения полос, без заметной потери активности. Ранее для зимографии α-амилазы широко использовался так называемый крахмально-пленочный протокол В.В. Доуэна. В этом протоколе гель нативной ПАГЭ использовали для разделения белков в гомогенате. Затем на поверхность геля на некоторое время накладывали тонкий гель с крахмалом, растворенным (или, точнее, суспендированным) в нем. После этого крахмал окрашивали раствором йода Лугола. Гелевая зимография часто применяется для обнаружения и анализа ферментов, продуцируемых микроорганизмами. Это привело к появлению различных модификаций стандартного протокола, например, смешанной субстратной зимографии. Обратная зимография сополимеризует субстрат и фермент с акриламидом и полезна для демонстрации активности ингибиторов ферментов. После окрашивания области ингибирования визуализируются в виде темных полос на светлом (или слабоокрашенном) фоне. В технике импринтинга фермент разделяют с помощью электрофореза в нативном геле, а затем гель накладывают на агарозный гель, обработанный субстратом. Зимографию также можно применять для анализа других типов ферментов, включая ксиланазы, липазы и хитиназы.
The standard protocol may require modifications depending on the sample enzyme; for instance, D. melanogaster digestive glycosidases generally survive reducing conditions (i. e. the presence of 2 mercaptoethanol or DTT), and to an extent, heating. Indeed, the separations following heating to 50 °C tend to exhibit a substantial increase in band resolution, without appreciable loss of activity. A common protocol used in the past for zymography of α amylase activity was the so called starch film protocol of W. W. Doane. Here a native PAGE gel was run to separate the proteins in a homogenate. Subsequently, a thin gel with starch dissolved (or more properly, suspended) in it was overlaid for a period of time on top of the original gel. The starch was then stained with Lugol's iodine. Gel zymography is often used for the detection and analysis of enzymes produced by microorganisms. This has led to variations on the standard protocol e. g. mixed substrate zymography. Reverse zymography copolymerizes both the substrate and the enzyme with the acrylamide, and is useful for the demonstration of enzyme inhibitor activity. Following staining, areas of inhibition are visualized as dark bands against a clear (or lightly stained) background. In imprint technique, the enzyme is separated by native gel electrophoresis and the gel is laid on top of a substrate treated agarose. Zymography can also be applied to other types of enzymes, including xylanases, lipases and chitinases.