1977 жылы жасалған ДНК тізбектеу әдісі

Кіріспе

1977 жылы жасалған ДНК тізбектеу әдісі. Сангер тізбектеуі – ДНК тізбектеудің электрофорезді қолданатын әдісі және ДНК полимеразаның тізбекті тоқтатушы дидеоксинуклеотидтерді кездейсоқ қосуына негізделген. Фредерик Сангер және әріптестері 1977 жылы оны алғаш рет жасағаннан бастап, шамамен 40 жыл бойы ең көп қолданылатын тізбектеу әдісі болды. Оны алғаш рет 1986 жылы Applied Biosystems компаниясы коммерциялық түрде сатуға шығарды. Соңғы кезде Сангердің жоғары өнімді тізбектеуі келесі буын тізбектеу әдістерімен, әсіресе ірі масштабты, автоматтандырылған геномдық талдаулар үшін алмастырылды. Дегенмен, Сангер әдісі кішкентай жобалар үшін және терең тізбектеу нәтижелерін растау үшін кеңінен қолданыла береді. Оның Illumina сияқты қысқа оқылым технологияларынан артықшылығы бар, себебі ол > 500 нуклеотидті ДНК тізбектерін шығара алады және 99,99% дейін жоғары дәлдікпен өте төмен қателік деңгейін сақтайды. Сангер тізбектеуі әлі де SARS-CoV-2 вирусының қырлы ақуызын тізбектеу сияқты халық денсаулығын жақсарту мақсатындағы бастамаларда және Ауруларды бақылау және алдын алу орталығының (CDC) CaliciNet бақылау желісі арқылы норовирус инфекцияларын қадағалауда белсенді түрде қолданылуда.

Әдіс

Классикалық тізбекті аяқтау әдісі бір жіпті ДНК үлгісін, ДНК праймерін, ДНК полимеразасын, қалыпты дезоксинуклеотид трифосфаттарын (dNTP) және модификацияланған дидезоксинуклеотид трифосфаттарын (ddNTP) қажет етеді, соңғылары ДНК тізбегінің ұзартылуын тоқтатады. Бұл тізбекті аяқтайтын нуклеотидтерде екі нуклеотидтің арасында фосфодиэстерлік байланыс құру үшін қажетті 3' OH тобы жоқ, бұл модификацияланған ddNTP қосылған кезде ДНК полимеразаның ДНК-ның кеңейуін тоқтатуына себеп болады. ddNTP автоматты секвенирлеу машиналарында анықтау үшін радиоактивті немесе флуоресценттік таңбалануы мүмкін. ДНК үлгісі төрт бөлек секвенирлеу реакциясына бөлінеді, онда барлық төрт стандартты дезоксинуклеотидтер (dATP, dGTP, dCTP және dTTP) және ДНК полимеразасы болады. Әр реакцияға төрт дидеоксинуклеотидтің (ddATP, ddGTP, ddCTP немесе ddTTP) біреуі ғана қосылады, ал қалған қосылған нуклеотидтер қалыпты нуклеотидтер болады. Дезоксинуклеотид концентрациясы сәйкес дидезоксинуклеотид концентрациясынан шамамен 100 есе жоғары болуы керек (мысалы, 0,5 мМ dTTP : 0,005 мМ ddTTP), толық тізбекті транскрипциялау кезінде жеткілікті фрагменттер өндірілуіне мүмкіндік беру үшін (бірақ ddNTP концентрациясы тізбектің қажетті ұзындығына да байланысты). Дәлірек айтқанда, осы төрт ddNTP-ні сынау үшін төрт бөлек реакция қажет. Байланған праймерден шаблон ДНК-ның бірнеше рет кеңеюінен кейін, алынған ДНК фрагменттері жылумен денатурацияланады және гельдік электрофорез арқылы мөлшері бойынша бөлінеді. 1977 жылғы түпнұсқа жарияланымда флуоресценттік таңбаланған ddNTP және праймерлер автоматтандырылған, жоғары өнімді ДНК секвенирлеуіне жол ашты. Тізбекті аяқтау әдістері ДНК секвенирлеуді едәуір жеңілдетті. Мысалы, тізбекті аяқтауға негізделген жиынтықтар сатылымда бар, олар секвенирлеуге қажетті реагенттерді қамтиды, алдын ала бөлінген және пайдалануға дайын. Шектеулерге праймердің ДНК-ға ерекше емес байланысуы, ДНК тізбегінің дұрыс оқылуына әсер етеді, және ДНК-ның екіншілік құрылымдары, тізбектің сенімділігіне әсер етеді, жатады.

The classical chain termination method requires a single stranded DNA template, a DNA primer, a DNA polymerase, normal deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and modified di deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), the latter of which terminate DNA strand elongation. These chain terminating nucleotides lack a 3' OH group required for the formation of a phosphodiester bond between two nucleotides, causing DNA polymerase to cease extension of DNA when a modified ddNTP is incorporated. The ddNTPs may be radioactively or fluorescently labelled for detection in automated sequencing machines. The DNA sample is divided into four separate sequencing reactions, containing all four of the standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) and the DNA polymerase. To each reaction is added only one of the four dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP), while the other added nucleotides are ordinary ones. The deoxynucleotide concentration should be approximately 100 fold higher than that of the corresponding dideoxynucleotide (e. g. 0.5mM dTTP : 0.005mM ddTTP) to allow enough fragments to be produced while still transcribing the complete sequence (but the concentration of ddNTP also depends on the desired length of sequence). Putting it in a more sensible order, four separate reactions are needed in this process to test all four ddNTPs. Following rounds of template DNA extension from the bound primer, the resulting DNA fragments are heat denatured and separated by size using gel electrophoresis. In the original publication of 1977, of fluorescently labeled ddNTPs and primers set the stage for automated, high throughput DNA sequencing. Chain termination methods have greatly simplified DNA sequencing. For example, chain termination based kits are commercially available that contain the reagents needed for sequencing, pre aliquoted and ready to use. Limitations include non specific binding of the primer to the DNA, affecting accurate read out of the DNA sequence, and DNA secondary structures affecting the fidelity of the sequence.

Түске бояуды тоқтатушыны реттілік

Түске терминаторлы тізбектеу, тізбек тоқтатушы ddNTP-лерді таңбалауды қолданады, бұл таңбаланған праймер әдісіндегідей төрт реакцияның орнына бір реакцияда тізбектеуге мүмкіндік береді. Түске терминаторлы тізбектеуде төрт дидеоксинуклеотидтік тізбек тоқтатушының әрқайсысы әртүрлі толқын ұзындығында жарық шығаратын флуоресцентті бояулармен таңбаланады. Ыңғайлылығы мен жылдамдығының арқасында түске терминаторлы тізбектеу қазіргі таңда автоматтандырылған тізбектеудің басты әдісі болып табылады. Оның шектеулеріне ДНК фрагментіне бояумен таңбаланған тізбек тоқтатушыларды қосудағы айырмашылықтарға байланысты бояу эффектілері жатады, нәтижесінде капиллярлық электрофорезден кейін электрондық ДНК тізбегінің хроматограммасында тең емес шыңдардың биіктігі мен пішіні байқалады (сол жақтағы суретті қараңыз). Бұл мәселе өзгертілген ДНК полимераза фермент жүйелерін және бояуларды қолдану арқылы, олар қосылудың өзгеруін азайтады, сондай-ақ "бояу дақтарын" жою әдістерімен шешілді. Түске терминаторлы тізбектеу әдісі, автоматтандырылған жоғары өнімді ДНК тізбектелгіштерімен бірге, жаңа буын тізбектеу енгізілгенге дейін көптеген тізбектеу жобаларында қолданылды.

Автоматтандыру және үлгілерді дайындау

Автоматтандырылған ДНК тізбектеу құралдары (ДНК тізбектеуіштер) бір партияда 384 ДНК үлгісіне дейін тізбектей алады. Бір күнде 24 ретке дейін партиялық жүгірулер болуы мүмкін. ДНК тізбектеуіштер капиллярлық электрофорезді пайдаланып жіптерді мөлшеріне (немесе ұзындығына) қарай бөледі, бояудың флуоресценциясын анықтап жазады және деректерді флуоресценттік шыңдардың хроматограммалық іздері түрінде шығарады. Үлгілерді тізбектеуішге жүктеу алдында тізбектеу реакциялары (термоциклдеу және белгілеу), тазалау және үлгілерді буферлік ерітіндіде қайта еріту бөлек жүргізіледі. Көптеген коммерциялық және коммерциялық емес бағдарламалық қамтамасыздар төмен сапалы ДНК іздерін автоматты түрде қысқартуға мүмкіндік береді. Бұл бағдарламалар әрбір шыңның сапасын бағалап, төмен сапалы базалық шыңдарды (әдетте тізбектің басында немесе соңында орналасқан) жояды. Мұндай алгоритмдердің дәлдігі адам операторының көзбен қарауынан төмен, бірақ үлкен тізбектелген деректер жиынтығын автоматты түрде өңдеу үшін жеткілікті.

Бояуды аяқтау реттілігін қолдану

Қоғамдық денсаулық сақтау саласы пациенттердің диагностикасын, сондай-ақ потенциалды улы заттар мен айналымдағы биологиялық патогендерді қоршаған ортада бақылауды қолдау үшін көптеген қызметтер атқарады. Әлемдегі қоғамдық денсаулық сақтау зертханалары (PHL) және басқа да зертханалар 2020 жылдың 30 қаңтарында қоғамдық денсаулық сақтау саласында төтенше жағдай жарияланған пандемия кезінде COVID-19-дың себепші факторы – SARS-CoV-2 вирусын бақылау үшін жылдам тізбектеу деректерін ұсынуда маңызды рөл атқарды. Зертханаларға секвенирлеу әдістерін тез енгізу міндеті жүктелді және вирустың таралуын азайту саясатын әзірлеу үшін шешім қабылдау моделіне көмектесу үшін дәл деректер беру сұралды. Көптеген зертханалар келесі буын секвенирлеу әдістемелерін пайдаланды, ал басқалары Сангер секвенирлеуін қолдады. SARS-CoV-2 вирусын секвенирлеу бойынша көптеген жұмыстар жүргізілді, көптеген зертханалар вирустың толық геномдық секвенирлеуін жүзеге асырды, ал кейбіреулері вирустың S гені сияқты нақты гендерін секвенирлеуді таңдады, ол шикі ақуызды өндіру үшін қажетті ақпаратты кодтайды. SARS-CoV-2 вирусының жоғары мутациялық деңгейі S генінің генетикалық айырмашылықтарына әкеледі және бұл айырмашылықтар вирустың жұқпалылығына әсер етеді. S генін Сангер секвенирлеу арқылы генетикалық кодты жылдам, дәл және үнемді алуға болады. Аз дамыған елдердегі зертханаларда келесі буын секвенирлеу сияқты қымбат технологияларды енгізу мүмкіндігі болмауы мүмкін, сондықтан Сангер әдістері варианттарды бақылау үшін секвенирлеу деректерін жасауға көмектеседі. Сангер секвенирлеуі Ауруларды бақылау және алдын алу орталығының (CDC) CaliciNet желісі үшін норовирусты бақылау әдістерінің "алтын стандарты" болып табылады. CaliciNet – 2009 жылдың наурыз айында құрылған жұқпалы ауруларды бақылау желісі. Желінің мақсаты – АҚШ-та айналымдағы норовирустардың тізбектеу деректерін жинау және вирустың таралуын азайту үшін инфекцияның көзін анықтау үшін келесі қадамдарды іске қосу. CaliciNet желісі көптеген инфекцияларды тағам арқылы жұғатын аурулар ретінде анықтады. ДНК фрагменттері тізбектеуден бұрын клондалған жағдайда, алынған тізбек клондау векторының бөліктерін қамтуы мүмкін. Ал ПТР-ге негізделген клондау және пиросекуенттеуге негізделген келесі буын секвенирлеу технологиялары көбінесе клондау векторларын пайдаланудан аулақ болады. Жақында Ampliseq және SeqSharp сияқты бір қадамды Сангер секвенирлеу (біріктірілген амплификация және секвенирлеу) әдістері әзірленді, олар мақсатты гендерді клондау немесе алдын ала амплификациясыз жылдам тізбектеуге мүмкіндік береді. Қазіргі әдістер бір реакцияда салыстырмалы түрде қысқа (300-1000 нуклеотид ұзындығы) ДНК фрагменттерін ғана тікелей тізбектей алады. ДНК фрагменттерін осы өлшем шегінен жоғары секвенирлеудің басты кедергісі – ұзындығы бір нуклеотидпен ғана ерекшеленетін үлкен ДНК фрагменттерін ажырату үшін жеткіліксіз ажыратымдылық.

The field of public health plays many roles to support patient diagnostics as well as environmental surveillance of potential toxic substances and circulating biological pathogens. Public health laboratories (PHL) and other laboratories around the world have played a pivotal role in providing rapid sequencing data for the surveillance of the virus SARS CoV 2, causative agent for COVID 19, during the pandemic that was declared a public health emergency on January 30, 2020. Laboratories were tasked with the rapid implementation of sequencing methods and asked to provide accurate data to assist in the decision making models for the development of policies to mitigate spread of the virus. Many laboratories resorted to next generation sequencing methodologies while others supported efforts with Sanger sequencing. The sequencing efforts of SARS CoV 2 are many, while most laboratories implemented whole genome sequencing of the virus, others have opted to sequence very specific genes of the virus such as the S gene, encoding the information needed to produce the spike protein. The high mutation rate of SARS CoV 2 leads to genetic differences within the S gene and these differences have played a role in the infectivity of the virus. Sanger sequencing of the S gene provides a quick, accurate, and more affordable method to retrieving the genetic code. Laboratories in lower income countries may not have the capabilities to implement expensive applications such as next generation sequencing, so Sanger methods may prevail in supporting the generation of sequencing data for surveillance of variants. Sanger sequencing is also the "gold standard" for norovirus surveillance methods for the Center for Disease Control and Prevention's (CDC) CaliciNet network. CalciNet is an outbreak surveillance network that was established in March 2009. The goal of the network is to collect sequencing data of circulating noroviruses in the United States and activate downstream action to determine the source of infection to mitigate the spread of the virus. The CalciNet network has identified many infections as foodborne illnesses. In cases where DNA fragments are cloned before sequencing, the resulting sequence may contain parts of the cloning vector. In contrast, PCR based cloning and next generation sequencing technologies based on pyrosequencing often avoid using cloning vectors. Recently, one step Sanger sequencing (combined amplification and sequencing) methods such as Ampliseq and SeqSharp have been developed that allow rapid sequencing of target genes without cloning or prior amplification. Current methods can directly sequence only relatively short (300 1000 nucleotides long) DNA fragments in a single reaction. The main obstacle to sequencing DNA fragments above this size limit is insufficient power of separation for resolving large DNA fragments that differ in length by only one nucleotide.

Микрофлюидтық Сангер реттілігі

Микрофлюидтық Сангерлік тізбектеу – ДНК тізбектеуге арналған чиптегі зертханалық қолданба. Онда Сангерлік тізбектеу қадамдары (термиялық цикл, үлгіні тазарту және капиллярлық электрофорез) нанолитрлік көлемдегі үлгілерді пайдалана отырып, вафлилік масштабтағы чипке біріктіріледі. Бұл технология ұзақ және дәл тізбектерді оқуға мүмкіндік береді, сонымен қатар дәстүрлі Сангерлік әдістің көптеген маңызды кемшіліктерін жояды (мысалы, қымбат реагенттердің көп мөлшерде қолданылуы, қымбат жабдыққа тәуелділік, көп еңбек талап ететін манипуляциялар және т.б.) Сангерлік тізбектеу қадамдарын біріктіру және автоматтандыру арқылы. Қазіргі заманғы жоғары өнімді геномдық тізбектеу геномды кішкентай, бір тізбекті фрагменттерге бөлуді, содан кейін фрагменттерді полимераза тізбекті реакциясы (ПТР) арқылы күшейтуді қамтиды. Сангерлік әдісті пайдалана отырып, әр ДНК фрагменті флуоресценттік таңбаланған дидеокси тізбекті аяқтайтын нуклеотид қосылуымен өздігінен тоқтатылады, осылайша әрқайсысының ұзындығы бір базаға өзгеше болатын және терминалдық базасында базаға тән флуоресценттік таңбасы бар ДНК "сатысы" пайда болады. Күшейтілген базалық сатылар капиллярлық массивтік электрофорез (КАЭ) арқылы флуоресценттік таңбаланған бір тізбекті ДНК фрагменттерін автоматты түрде анықтау арқылы бөлінеді, бұл фрагменттердің реттелген тізбегін қамтамасыз етеді. Осы тізбектер компьютерде толық жиналғаннан кейін толық геномдық тізбекке ұқсайтын, бірімен-бірі жапсарлас немесе жалғасқан тізбектерге ("контигтер") жиналады.

Құрылғының құрылысы

Секвенциялау чипі төрт қабатты құрылымнан тұрады, оған 100 мм диаметрлі үш шыны пластина (олардың үстінде құрылғы элементтері микрофабрикацияланған) және полидиметилсилоксан (PDMS) мембранасы кіреді. Реакциялық камералар мен капиллярлық электрофорез арналары екі жоғарғы шыны пластина арасында ойылып жасалған және термиялық байланыс арқылы біріктірілген. Көп өлшемді арналардың байланысы және микрованналар PDMS және төменгі жинақтағыш шыны пластинадан жасалған. Құрылғы үш функционалдық бөлімнен тұрады, олардың әрқайсысы Сангер секвенциялау кезеңдеріне сәйкес келеді. Термиялық цикл (TC) бөлімі – 250 нанолитрлік реакциялық камера, онда интеграцияланған кедергілік температура даткіші, микрованналар және беттік жылытқыш орналасқан. Реагенттің жоғарғы шыны қабаты мен төменгі PDMS қабаты арасындағы қозғалысы 500 мкм диаметрлі тесіктер арқылы жүзеге асырылады. Термиялық циклден кейін реакциялық қоспа жинақтау/тазарту камерасында тазартылып, содан кейін капиллярлық электрофорез (CE) камерасына жіберіледі. CE бөлімі 30 см капиллярдан тұрады, ол 65 мкм ені бар бұрылыстар арқылы ықшам зигзаг тәрізді пішінге бүктеледі.

Платформалар

Apollo 100 платформасы (Microchip Biotechnologies Inc., Дублин, Калифорния) Сангер секвенделеуінің алғашқы екі қадамын (термиялық цикл және тазарту) толық автоматтандырылған жүйеде біріктіреді. Өндіруші үлгі мен реагенттер жүйеге салыныстан кейін үш сағат ішінде капиллярлық электрофорезге дайын болатынын мәлімдейді. Apollo 100 платформасына реагенттердің микролитрден азырақ көлемі қажет.

Басқа секвенирлеу әдістерімен салыстыру

+ Геномды секвенирлеу технологияларының өнімділік көрсеткіштері, Сангер әдістері және жаңа буын әдістерін қоса алғанда. Технология Жолдар саны Инъекция көлемі (нл) Талдау уақыты Орташа оқу ұзындығы Шығымдылық (талдауды қоса алғанда; Мб/сағ) Гель құю Жолды қадағалау Slab гелі 96 500–1000 6–8 сағат 700 бп 0.0672 Иә Иә Капиллярлық массив электрофорезі 96 1–5 1–3 сағат 700 бп 0.166 Жоқ Жоқ Микрочип 96 0.1–0.5 6–30 минут 430 бп 0.660 Жоқ Жоқ 454/Roche FLX (2008) < 0.001 4 сағат 200–300 бп 20–30 Illumina/Solexa (2008) 2–3 күн 30–100 бп 20 ABI/SOLiD (2008) 8 күн 35 бп 5–15 Illumina MiSeq (2019) 1–3 күн 2x75–2x300 бп 170–250 Illumina NovaSeq (2019) 1–2 күн 2x50–2x150 бп 22,000–67,000 Ion Torrent Ion 530 (2019) 2.5–4 сағат 200–600 бп 110–920 BGI MGISEQ T7 (2019) 1 күн 2x150 бп 250,000 Pacific Biosciences Revio (2023) 12 30 сағат 15–25 кб 15,000 Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 күн 13–20 кб 700

Жоғары өнімді секвенирлеудің басты мақсаты – төмен құнмен және ұзақ оқу ұзындықтарын алуда өте тиімді жүйелерді әзірлеу. Әрбір электрофоретикалық бөліністің ұзақ оқу ұзындығы, de novo ДНК секвенирлеуге байланысты шығындарды және белгілі бір артықтықта ДНК контигтерін секвенирлеу үшін қажетті шаблон санын айтарлықтай азайтады. Микрофлюидика жылдам, арзан және оңай тізбек құрастыруға мүмкіндік беруі мүмкін.