Метод Сэнгера: История и современное применение секвенирования ДНК.

Введение

Метод секвенирования ДНК, разработанный в 1977 году, – это метод секвенирования ДНК, включающий электрофорез и основанный на случайном включении дидеоксинуклеотидов, обрывающих цепь, ДНК-полимеразой в процессе репликации ДНК in vitro. Разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году, он оставался наиболее широко используемым методом секвенирования на протяжении примерно 40 лет. Впервые коммерциализирован компанией Applied Biosystems в 1986 году. В последнее время секвенирование по Сэнгеру в больших объемах уступает место методам секвенирования нового поколения, особенно для крупномасштабного автоматизированного анализа геномов. Однако метод Сэнгера по-прежнему широко применяется для небольших проектов и для валидации результатов глубокого секвенирования. Он сохраняет преимущество перед технологиями секвенирования с короткими прочтениями (например, Illumina), поскольку позволяет получать прочтения последовательности ДНК длиной более 500 нуклеотидов и обеспечивает очень низкий уровень ошибок с точностью около 99,99%. Секвенирование по Сэнгеру активно используется в инициативах общественного здравоохранения, таких как секвенирование S-белка вируса SARS-CoV-2, а также для эпиднадзора за вспышками норовирусной инфекции через сеть наблюдения CaliciNet Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC).

Метод

Для классического метода обрыва цепи требуется одноцепочечный ДНК-шаблон, ДНК-праймер, ДНК-полимераза, обычные дезоксинуклеотидные трифосфаты (dNTP) и модифицированные дидезоксинуклеотидные трифосфаты (ddNTP), последние из которых прекращают удлинение цепи ДНК. Эти обрывающие цепь нуклеотиды лишены 3'-OH группы, необходимой для формирования фосфодиэфирной связи между двумя нуклеотидами, что приводит к прекращению полимеразой удлинения ДНК при включении модифицированного ddNTP. ddNTP могут быть мечены радиоактивно или флуоресцентно для детекции в автоматизированных секвенаторах. Образец ДНК разделяют на четыре отдельные секвенирующие реакции, содержащие все четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и ДНК-полимеразу. В каждую реакцию добавляется только один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP), а остальные добавленные нуклеотиды – обычные. Концентрация дезоксинуклеотида должна быть примерно в 100 раз выше, чем концентрация соответствующего дидезоксинуклеотида (например, 0,5 мМ dTTP : 0,005 мМ ddTTP), чтобы обеспечить получение достаточного количества фрагментов при одновременном считывании полной последовательности (однако концентрация ddNTP также зависит от желаемой длины последовательности). Если рассматривать это в более логичном порядке, для проверки всех четырех ddNTP в этом процессе необходимы четыре отдельные реакции. После нескольких раундов удлинения ДНК-шаблона от связанного праймера, полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют по размеру с помощью электрофореза в геле. В оригинальной публикации 1977 года использование флуоресцентно меченных ddNTP и праймеров заложило основу для автоматизированного высокопроизводительного секвенирования ДНК. Методы обрыва цепи значительно упростили секвенирование ДНК. Например, в продаже имеются наборы, основанные на методе обрыва цепи, содержащие необходимые для секвенирования реагенты, предварительно аликвотированные и готовые к использованию. Ограничения включают неспецифическое связывание праймера с ДНК, что влияет на точное считывание последовательности ДНК, и вторичные структуры ДНК, влияющие на достоверность последовательности.

The classical chain termination method requires a single stranded DNA template, a DNA primer, a DNA polymerase, normal deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and modified di deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), the latter of which terminate DNA strand elongation. These chain terminating nucleotides lack a 3' OH group required for the formation of a phosphodiester bond between two nucleotides, causing DNA polymerase to cease extension of DNA when a modified ddNTP is incorporated. The ddNTPs may be radioactively or fluorescently labelled for detection in automated sequencing machines. The DNA sample is divided into four separate sequencing reactions, containing all four of the standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) and the DNA polymerase. To each reaction is added only one of the four dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP), while the other added nucleotides are ordinary ones. The deoxynucleotide concentration should be approximately 100 fold higher than that of the corresponding dideoxynucleotide (e. g. 0.5mM dTTP : 0.005mM ddTTP) to allow enough fragments to be produced while still transcribing the complete sequence (but the concentration of ddNTP also depends on the desired length of sequence). Putting it in a more sensible order, four separate reactions are needed in this process to test all four ddNTPs. Following rounds of template DNA extension from the bound primer, the resulting DNA fragments are heat denatured and separated by size using gel electrophoresis. In the original publication of 1977, of fluorescently labeled ddNTPs and primers set the stage for automated, high throughput DNA sequencing. Chain termination methods have greatly simplified DNA sequencing. For example, chain termination based kits are commercially available that contain the reagents needed for sequencing, pre aliquoted and ready to use. Limitations include non specific binding of the primer to the DNA, affecting accurate read out of the DNA sequence, and DNA secondary structures affecting the fidelity of the sequence.

Секвенция красителя-терминатора

Секвенирование по терминаторам красителей использует мечение цепных терминаторов ddNTP, что позволяет проводить секвенирование в одной реакции, а не в четырех, как в методе меченых праймеров. В секвенировании по терминаторам красителей каждый из четырех дидезоксинуклеотидных цепных терминаторов мечен флуоресцентными красителями, каждый из которых испускает свет на разной длине волны. Благодаря большей эффективности и скорости, секвенирование по терминаторам красителей сейчас является основным методом автоматизированного секвенирования. Его ограничения включают эффект красителя, вызванный различиями во включении меченых красителями цепных терминаторов в фрагмент ДНК, что приводит к неравномерным высотам и формам пиков в электронной хроматограмме следа последовательности ДНК после капиллярного электрофореза (см. рисунок слева). Эта проблема была решена за счет использования модифицированных ферментных систем ДНК-полимеразы и красителей, минимизирующих вариабельность включения, а также методов устранения "красочных пятен". Метод секвенирования по терминаторам красителей, вместе с автоматизированными высокопроизводительными анализаторами последовательностей ДНК, использовался для большинства проектов секвенирования до появления секвенирования нового поколения.

Автоматизация и подготовка образцов

Автоматизированные приборы для секвенирования ДНК (секвенсоры ДНК) могут секвенировать до 384 образцов ДНК за один запуск. Запуски могут выполняться до 24 раз в сутки. Секвенсоры ДНК разделяют цепи по размеру (или длине) с использованием капиллярного электрофореза, обнаруживают и регистрируют флуоресценцию красителей и выводят данные в виде хромотограмм пиковых следов флуоресценции. Реакции секвенирования (термоциклирование и мечение), очистка и ресуспензия образцов в буферном растворе проводятся отдельно, до загрузки образцов в секвенсор. Существует ряд коммерческих и некоммерческих программных пакетов, которые могут автоматически обрезать участки ДНК низкого качества. Эти программы оценивают качество каждого пика и удаляют низкокачественные пики оснований (которые обычно расположены на концах последовательности). Точность этих алгоритмов уступает визуальному анализу, выполняемому специалистом, но достаточна для автоматизированной обработки больших наборов данных секвенирования.

Применение последовательности с окончанием красителя

Общественное здравоохранение играет важную роль в поддержке диагностики пациентов, а также в экологическом мониторинге потенциально токсичных веществ и циркулирующих биологических патогенов. Лаборатории общественного здравоохранения (ЛОЗ) и другие лаборатории по всему миру сыграли ключевую роль в предоставлении оперативных данных секвенирования для мониторинга вируса SARS-CoV-2, вызывающего COVID-19, во время пандемии, объявленной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения 30 января 2020 года. Перед лабораториями стояла задача быстрого внедрения методов секвенирования и предоставления точных данных для поддержки принятия решений при разработке стратегий по сдерживанию распространения вируса. Многие лаборатории использовали методы секвенирования нового поколения, в то время как другие поддерживали усилия с помощью секвенирования по Сэнгеру. Работы по секвенированию SARS-CoV-2 многочисленны: большинство лабораторий проводили секвенирование всего генома вируса, а некоторые выбрали секвенирование отдельных генов, таких как ген S, кодирующий информацию, необходимую для производства спайкового белка. Высокая частота мутаций SARS-CoV-2 приводит к генетическим различиям в гене S, которые влияют на инфекционность вируса. Секвенирование гена S методом Сэнгера обеспечивает быстрый, точный и более экономичный способ получения генетического кода. Лаборатории в странах с низким уровнем дохода могут не иметь возможности использовать дорогостоящие технологии, такие как секвенирование нового поколения, поэтому методы Сэнгера могут оставаться основным способом получения данных секвенирования для мониторинга вариантов. Секвенирование по Сэнгеру также является «золотым стандартом» для методов мониторинга норовирусов в сети CaliciNet Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC). CaliciNet – это сеть мониторинга вспышек, созданная в марте 2009 года. Целью сети является сбор данных секвенирования циркулирующих норовирусов в Соединенных Штатах и инициирование дальнейших действий для определения источника инфекции и сдерживания распространения вируса. Сеть CaliciNet выявила множество инфекций как пищевые отравления. В случаях, когда фрагменты ДНК клонируются перед секвенированием, полученная последовательность может содержать части клонирующего вектора. В отличие от этого, клонирование на основе ПЦР и технологии секвенирования нового поколения, основанные на пиросеквенировании, часто позволяют избежать использования клонирующих векторов. Недавно были разработаны одностадийные методы секвенирования по Сэнгеру (комбинированная амплификация и секвенирование), такие как Ampliseq и SeqSharp, которые позволяют быстро секвенировать целевые гены без клонирования или предварительной амплификации. Современные методы позволяют непосредственно секвенировать только относительно короткие (300–1000 нуклеотидов) фрагменты ДНК в одной реакции. Основным препятствием для секвенирования фрагментов ДНК, превышающих этот размер, является недостаточная разрешающая способность для разделения крупных фрагментов ДНК, различающихся по длине всего на один нуклеотид.

The field of public health plays many roles to support patient diagnostics as well as environmental surveillance of potential toxic substances and circulating biological pathogens. Public health laboratories (PHL) and other laboratories around the world have played a pivotal role in providing rapid sequencing data for the surveillance of the virus SARS CoV 2, causative agent for COVID 19, during the pandemic that was declared a public health emergency on January 30, 2020. Laboratories were tasked with the rapid implementation of sequencing methods and asked to provide accurate data to assist in the decision making models for the development of policies to mitigate spread of the virus. Many laboratories resorted to next generation sequencing methodologies while others supported efforts with Sanger sequencing. The sequencing efforts of SARS CoV 2 are many, while most laboratories implemented whole genome sequencing of the virus, others have opted to sequence very specific genes of the virus such as the S gene, encoding the information needed to produce the spike protein. The high mutation rate of SARS CoV 2 leads to genetic differences within the S gene and these differences have played a role in the infectivity of the virus. Sanger sequencing of the S gene provides a quick, accurate, and more affordable method to retrieving the genetic code. Laboratories in lower income countries may not have the capabilities to implement expensive applications such as next generation sequencing, so Sanger methods may prevail in supporting the generation of sequencing data for surveillance of variants. Sanger sequencing is also the "gold standard" for norovirus surveillance methods for the Center for Disease Control and Prevention's (CDC) CaliciNet network. CalciNet is an outbreak surveillance network that was established in March 2009. The goal of the network is to collect sequencing data of circulating noroviruses in the United States and activate downstream action to determine the source of infection to mitigate the spread of the virus. The CalciNet network has identified many infections as foodborne illnesses. In cases where DNA fragments are cloned before sequencing, the resulting sequence may contain parts of the cloning vector. In contrast, PCR based cloning and next generation sequencing technologies based on pyrosequencing often avoid using cloning vectors. Recently, one step Sanger sequencing (combined amplification and sequencing) methods such as Ampliseq and SeqSharp have been developed that allow rapid sequencing of target genes without cloning or prior amplification. Current methods can directly sequence only relatively short (300 1000 nucleotides long) DNA fragments in a single reaction. The main obstacle to sequencing DNA fragments above this size limit is insufficient power of separation for resolving large DNA fragments that differ in length by only one nucleotide.

Микрофлюидный анализ Сангера

Микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру – это применение концепции «лаборатории на чипе» для секвенирования ДНК, в котором этапы секвенирования по Сэнгеру (термическое циклирование, очистка образца и капиллярный электрофорез) интегрированы на чипе в масштабе пластины с использованием объемов образцов в нанолитровом диапазоне. Эта технология генерирует длинные и точные результаты секвенирования, устраняя многие существенные недостатки традиционного метода Сэнгера (например, высокое потребление дорогих реагентов, зависимость от дорогостоящего оборудования, трудоемкие манипуляции с образцами и т.д.) за счет интеграции и автоматизации этапов секвенирования по Сэнгеру. В современных подходах высокопроизводительное секвенирование генома включает фрагментацию генома на небольшие одноцепочечные фрагменты, за которой следует амплификация этих фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Используя метод Сэнгера, каждый фрагмент ДНК необратимо завершается включением флуоресцентно меченого дидезоксинуклеотида, завершающего цепь, тем самым создавая «лестницу» ДНК-фрагментов, каждый из которых отличается от другого на одну нуклеотидную основу и несет специфическую для этой основы флуоресцентную метку на конце. Усиленные «лестницы» оснований затем разделяются с помощью капиллярного электрофореза (CAE) с автоматизированным, in situ обнаружением флуоресцентно меченых одноцепочечных фрагментов ДНК на «финишной прямой», что обеспечивает упорядоченную последовательность фрагментов. Эти результаты секвенирования затем собираются компьютером в перекрывающиеся или контигуальные последовательности (называемые «контигами»), которые, после полной сборки, соответствуют полной геномной последовательности.

Конструкция устройства

Чип секвенирования имеет четырехслойную конструкцию, состоящую из трех стеклянных пластин диаметром 100 мм (на которых микрофабрикуются элементы устройства) и мембраны из полидиметилсилоксана (PDMS). Камеры реакций и каналы капиллярного электрофореза травятся между двумя верхними стеклянными пластинами, которые термосвязаны. Трехмерные межканальные соединения и микроклапаны формируются PDMS и нижней коллекторной стеклянной пластиной. Устройство состоит из трех функциональных блоков, каждый из которых соответствует этапам секвенирования по Сэнгеру. Термоциклический блок представляет собой реакционную камеру объемом 250 нанолитров с интегрированным резистивным датчиком температуры, микроклапанами и поверхностным нагревателем. Перемещение реагентов между верхним стеклянным слоем и нижним слоем PDMS происходит через отверстия диаметром 500 мкм. После термоциклирования реакционная смесь подвергается очистке в камере захвата/очистки, а затем вводится в камеру капиллярного электрофореза (CE). Блок CE состоит из капилляра длиной 30 см, сложенного в компактную зигзагообразную структуру с помощью поворотов шириной 65 мкм.

Платформы

Платформа Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Dublin, CA) объединяет первые два этапа секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование и очистку) в полностью автоматизированную систему. Производитель заявляет, что образцы готовы к капиллярному электрофорезу в течение трех часов после загрузки образца и реагентов в систему. Для работы с платформой Apollo 100 требуются субмикролитровые объемы реагентов.

Сравнение с другими методами секвенирования

+ Значения производительности для технологий секвенирования генома, включая методы Сэнгера и методы следующего поколения. Технология Количество дорожек Объем инъекции (нл) Время анализа Средняя длина чтения Пропускная способность (включая анализ; Мб/ч) Залив геля Отслеживание дорожек Гелевая пластина 96 500–1000 6–8 часов 700 п.н. 0.0672 Да Да Капиллярный электрофорез с микроматрицей 96 1–5 1–3 часа 700 п.н. 0.166 Нет Нет Микрочип 96 0.1–0.5 6–30 минут 430 п.н. 0.660 Нет Нет 454/Roche FLX (2008) < 0.001 4 часа 200–300 п.н. 20–30 Illumina/Solexa (2008) 2–3 дня 30–100 п.н. 20 ABI/SOLiD (2008) 8 дней 35 п.н. 5–15 Illumina MiSeq (2019) 1–3 дня 2x75–2x300 п.н. 170–250 Illumina NovaSeq (2019) 1–2 дня 2x50–2x150 п.н. 22,000–67,000 Ion Torrent Ion 530 (2019) 2.5–4 часа 200–600 п.н. 110–920 BGI MGISEQ T7 (2019) 1 день 2x150 п.н. 250,000 Pacific Biosciences Revio (2023) 12 30 часов 15–25 кб 15,000 Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 дня 13–20 кб 700

Конечная цель высокопроизводительного секвенирования – разработка систем с низкой стоимостью и чрезвычайно высокой эффективностью получения расширенных (более длинных) длин прочтений. Более длинные длины прочтений при каждом отдельном электрофоретическом разделении существенно снижают стоимость секвенирования de novo ДНК и количество шаблонов, необходимых для секвенирования ДНК-контигов при заданной избыточности. Микрофлюидика может обеспечить более быстрое, дешевое и простое построение генома.