ΦX174 бактериофагы: құрылымы, геномы және репликациясы
Phi X 174
ΦX174 бактериофагы: E. coli бактериясын жұқтыратын бір тізбекті ДНК вирусы. 1977 ж. толық геномдық тізбегі анықталды. Вирустар, бактериофагтар туралы ақпарат.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Бактерияларды жұқтыратын бір жіпті ДНК вирусы.
A single stranded DNA virus that infects bacteria
Phi X 174 (немесе ΦX174) бактериофагы – Escherichia coli бактериясын жұқтыратын бір жіпті ДНК (ssDNA) вирусы. Бұл вирус 1935 жылы Николас Булгаков Пастер институтындағы Феликс д’Эрель зертханасында Париж кәріздерінен алынған үлгілерден оқшауланды. Оның сипаттамасы және репликация механизмін зерттеу 1950 жылдардан бастап жүргізілді. Бұл ДНК-ға негізделген алғашқы тізбектелген геном. Бұл жұмысты Фред Сангер және оның командасы 1977 жылы аяқтады. 1962 жылы Уолтер Файерс пен Роберт Синсхаймер ΦX174 ДНК-ның физикалық, ковалентті жабық шеңберлігін көрсетті. Нобель сыйлығының иегері Артур Корнберг ΦX174-ті үлгі ретінде пайдаланып, тазартылған ферменттермен сынақ түтігінде синтезделген ДНК табиғи вирустың барлық қасиеттерін тудыра алатынын дәлелдеді, осылайша синтетикалық биология дәуірін ашты. 1972–1974 жылдары Джерард Хурвиц, Сью Викнер және Рид Викнер, сондай-ақ олардың әріптестері вирустың бір жіпті түрінің екі жіпті репликациялық түріне айналуын катализдейтін ферменттерді өндіруге қажетті гендерді анықтады. 2003 жылы Крейг Вентер тобы ΦX174 геномының синтезделген олигонуклеотидтерден in vitro алғаш рет толық құрастырылғанын хабарлады. ΦX174 вирусының бөлшегі де in vitro сәтті құрастырылды. 2012 жылы оның өте көп жапсырылған геномы толыққанды декомпрессияланып, әлі де функционалды болатыны көрсетілді.
The phi X 174 (or ΦX174) bacteriophage is a single stranded DNA (ssDNA) virus that infects Escherichia coli. This virus was isolated in 1935 by Nicolas Bulgakov in Félix d'Hérelle's laboratory at the Pasteur Institute, from samples collected in Paris sewers. Its characterization and the study of its replication mechanism were carried out from the 1950s onwards. It was the first DNA based genome to be sequenced. This work was completed by Fred Sanger and his team in 1977. In 1962, Walter Fiers and Robert Sinsheimer had already demonstrated the physical, covalently closed circularity of ΦX174 DNA. Nobel prize winner Arthur Kornberg used ΦX174 as a model to first prove that DNA synthesized in a test tube by purified enzymes could produce all the features of a natural virus, ushering in the age of synthetic biology. In 1972–1974, Jerard Hurwitz, Sue Wickner, and Reed Wickner with collaborators identified the genes required to produce the enzymes to catalyze conversion of the single stranded form of the virus to the double stranded replicative form. In 2003, it was reported by Craig Venter's group that the genome of ΦX174 was the first to be completely assembled in vitro from synthesized oligonucleotides. The ΦX174 virus particle has also been successfully assembled in vitro. In 2012, it was shown how its highly overlapping genome can be fully decompressed and still remain functional.
Геном
Бұл бактериофагтың 5386 нуклеотидтен тұратын, оң мағыналы, циркулярлық бір жіпті ДНК геномы бар. Қазіргі кезде ATT-ның E. coli ішінде әлі де белок өндіре алатыны белгілі, сондықтан бұл геннің маңызды болуы мүмкін. ΦX174 геномының бірінші жартысында гендердің үлкен мөлшерде жабысуы байқалады, 11 геннің сегізі кем дегенде бір нуклеотид бойынша үстігіп жатыр.
This bacteriophage has a [+] sense circular single stranded DNA genome of 5,386 nucleotides. It is now known that the ATT is still likely capable of producing protein within E. coli and therefore this gene may in fact be essential. The first half of the ΦX174 genome features high levels of gene overlap with eight out of 11 genes overlapping by at least one nucleotide.
Транскриптом
2020 жылы ΦX174 транскриптомы жасалды. ΦX174 транскриптомының ерекшелігі – бір-бірімен тізбектелген төртке дейін салыстырмалы түрде әлсіз промоторлар және төртке дейін Rho тәуелсіз (ішкі) терминаторлары мен бір Rho тәуелді терминатор.
In 2020, the transcriptome of ΦX174 was generated. Notable features of the ΦX174 transcriptome is a series of up to four relatively weak promoters in series with up to four Rho independent (intrinsic) terminators and one Rho dependent terminator.
Протеома
Жақында массалық спектрометрия көмегімен барлық ΦX174 ақуыздары анықталды.
Identification of all ΦX174 proteins using mass spectrometry has recently been reported.
Инфекция циклы
Инфекция G протеинінің бактериялық жазылушы клетка бетіндегі липополисахаридтерге байланысуымен басталады. H протеині (немесе ДНК пилоттық протеині) вирус геномын E. coli бактериясының бактериялық мембранасы арқылы, ең болжамды N терминалды трансмембраналық домен спиралі арқылы өткізеді. Дегенмен, H протеінінің көп қызметті протеин екені анықталды. Бұл ΦX174 вирус капсидінің кристалдық құрылымы жоқ жалғыз протеині. Оның ароматикалық мазмұны төмен және глицин мазмұны жоғары, бұл протеин құрылымын өте икемді етеді, сондай-ақ, жеке сутек атомдарын (глициндер үшін R тобы) протеин кристаллографиясында анықтау қиын. Сонымен қатар, H протеіні жоғары концентрацияда бактериялық жазылушының лизисін тудырады, себебі болжамды N терминалды трансмембраналық спираль бактериялық қабырғада оңай тесіктер жасайды. Биоинформатикалық мәліметтер бойынша, бұл протеінде белгілі транскрипция факторларына айтарлықтай гомологиясы бар төрт болжамды орамалық домен бар. Сонымен қатар, басқа вирус протеиндерін оңтайлы синтездеу үшін de novo H протеіні қажет екені анықталды. Вирусқа енуіне кедеріс келтіретін H протеініндегі мутациялар, ішкі қаңқа протеині В протеінінің артық мөлшерін қосу арқылы еңсерілуі мүмкін. ДНҚ гидрофильді арна арқылы 5 еселі төбеде шығарылады. H протеіні осы аймақта орналасқаны белгілі, бірақ тәжірибелік дәлелдер оның нақты орналасуын растаған жоқ. Жазылушы бактерияның ішінде [+] бір тізбекті ДНҚ геномының репликациясы теріс мағыналы ДНҚ аралық арқылы жүзеге асады. Бұл фаг геномының суперспиральға айналуымен және мұндай суперспиральдардың құрылымдық екінші деңгейі примосомалық протеин кешенін тартады. Бұл геномды айналып өтеді және оң түпнұсқа геномнан [−] бір тізбекті ДНҚ синтездейді. [+] бір тізбекті ДНҚ геномдары вирустарға жиналу үшін жылжымалы шеңбер механизмі арқылы құрылады. Бұл механизмде екі тізбекті суперспиральды геном вируспен кодталған А протеінімен оң тізбекте кесіледі, сондай-ақ бактериялық ДНҚ полимеразасын (DNAP) кесу орнына тартады. DNAP теріс тізбекті оң мағыналы ДНҚ жасау үшін үлгі ретінде пайдаланады. Ол геномды айналып өте келе, синтезделген ДНҚ-ның сыртқы тізбегін ығыстырып, оны бірден SSBP протеиндерімен қаптайды. А протеіні әр кезде түпнұсқа тізбекті тани отырып, толық геномды кесіп алады. D протеіні ең көп таралған ген транскрипті болғандықтан, вирус прокапсидіндегі ең көп протеин болып табылады. Сол сияқты, F, J және G гендерінің транскриптілері H-ге қарағанда көп, себебі бұл құрылымдық протеиндердің стехиометриясы 5:5:5:1 болып келеді. Примосомалар - фермент геликазасын шаблонға бекітетін/байлайтын протеин кешендері. Примосомалар ДНҚ синтезі үшін РНК праймерлерін жіптерге жеткізеді.
Infection begins when G protein binds to lipopolysaccharides on the bacterial host cell surface. H protein (or the DNA Pilot Protein) pilots the viral genome through the bacterial membrane of E. coli bacteria most likely via a predicted N terminal transmembrane domain helix. However, it has become apparent that H protein is a multifunctional protein. This is the only viral capsid protein of ΦX174 to lack a crystal structure for a couple of reasons. It has low aromatic content and high glycine content, making the protein structure very flexible and in addition, individual hydrogen atoms (the R group for glycines) are difficult to detect in protein crystallography. Additionally, H protein induces lysis of the bacterial host at high concentrations as the predicted N terminal transmembrane helix easily pokes holes through the bacterial wall. By bioinformatics, this protein contains four predicted coiled coil domains which has a significant homology to known transcription factors. Additionally, it was determined that de novo H protein was required for optimal synthesis of other viral proteins. Mutations in H protein that prevent viral incorporation, can be overcome when excess amounts of protein B, the internal scaffolding protein, are supplied. The DNA is ejected through a hydrophilic channel at the 5 fold vertex. It is understood that H protein resides in this area but experimental evidence has not verified its exact location. Once inside the host bacterium, replication of the [+] ssDNA genome proceeds via negative sense DNA intermediate. This is done as the phage genome supercoils and the secondary structure formed by such supercoiling attracts a primosome protein complex. This translocates once around the genome and synthesizes a [−]ssDNA from the positive original genome. [+]ssDNA genomes to package into viruses are created from this by a rolling circle mechanism. This is the mechanism by which the double stranded supercoiled genome is nicked on the positive strand by a virus encoded A protein, also attracting a bacterial DNA polymerase (DNAP) to the site of cleavage. DNAP uses the negative strand as a template to make positive sense DNA. As it translocates around the genome it displaces the outer strand of already synthesised DNA, which is immediately coated by SSBP proteins. The A protein cleaves the complete genome every time it recognises the origin sequence. As D protein is the most abundant gene transcript, it is the most protein in the viral procapsid. Similarly, gene transcripts for F, J, and G are more abundant than for H as the stoichiometry for these structural proteins is 5:5:5:1. The primosomes are protein complexes which attach/bind the enzyme helicase on the template. Primosomes gives RNA primers for DNA synthesis to strands.
Филогенетика және әртүрлілік
ΦX174 басқа микровирустармен, әсіресе NC фагымен (мысалы, NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51 және т.б.) тығыз байланысты. G4 сияқты фагтарға одан да алыс, ал α3 сияқты фагтарға одан да әлдеқайда алыс туысқан. Rokyta және авторлар тобы 2006 жылы олардың туыстығының филогенетикалық ағашын ұсынды.
ΦX174 is closely related to other microviridae, especially the NC phage (e. g. NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51, etc.) and more distantly related to the G4 like phages and even more distantly related to the α3 like phage. Rokyta et al. 2006 presented a phylogenetic tree of their relationships.
Эксперименталды эволюция
ΦX174 көптеген эволюциялық тәжірибелерде модельдік организм ретінде пайдаланылған.
ΦX174 has been used as a model organism in many evolution experiments.
Биотехнология
ΦX174 ДНҚ тізбектеуде оң бақылау ретінде жиі қолданылады, себебі басқа организмдермен салыстырғанда оның геномы салыстырмалы түрде кішкентай, нуклеотидтік құрамы шамамен теңдестірілген – 23% G, 22% C, 24% A және 31% T, яғни 45% G+C және 55% A+T (NC 001422.1 нөмірінде қараңыз). Бір Illumina тізбектеу жүргізілімі ΦX174 геномын бірнеше миллион рет жабуға мүмкіндік береді, бұл оны тарихтағы ең көп тізбектелген геномдардың бірі етеді. ΦX174 жеке қорғаныш жабдықтарының қан арқылы берілетін вирустарға төзімділігін тексеру үшін де қолданылады. Сондай-ақ, ΦX174 вирустық G капсидінің протеинінен пептидтерді көрсетуге (фаг дисплейі) мүмкіндік беру үшін модификацияланған.
ΦX174 is regularly used as a positive control in DNA sequencing due to its relatively small genome size in comparison to other organisms, its relatively balanced nucleotide content — about 23% G, 22% C, 24% A, and 31% T, i. e., 45% G+C and 55% A+T, see the accession NC 001422.1 and a single Illumina sequencing run can cover the ΦX174 genome several million times over, making this very likely the most heavily sequenced genome in history. ΦX174 is also used to test the resistance of personal protective equipment to bloodborne viruses. ΦX174 has also been modified to enable peptide display (phage display) from the viral capsid G protein.
Синтетикалық биология
ΦX174 геномы ашытқыда көшірмеленген алғашқы фаг болды, сонымен қатар ΦX174 барлық гендердің үстіне жабысуын жойып, толыққанды декомпрессияланған алғашқы геном болды. Бұл өзгерістердің нәтижесінде жаңа иесіне жабысудың айтарлықтай төмендеуіне, ақуыз өндірісінің бұзылуына және температураға сезімталдыққа әкелді.
The ΦX174 genome was the first phage to be cloned in yeast, ΦX174 was also the first genome to be fully decompressed, having all gene overlaps removed. The effect of these changes resulted in significantly reduced host attachment, protein expression dysregulation, and heat sensitivity.