Фаг ΦX174: История и особенности изучения бактериофага с одноцепочечной ДНК

Введение

Одноцепочечный вирус ДНК, который заражает бактерии.

Бактериофаг phi X 174 (или ΦX174) — это одноцепочечный вирус ДНК (ssDNA), который заражает Escherichia coli. Этот вирус был выделен в 1935 году Николасом Булгаковым в лаборатории Феликса д’Эреля в Институте Пастера из образцов, собранных в парижской канализации. Его характеристика и изучение механизма репликации проводились начиная с 1950-х годов. Он стал первым геномом на основе ДНК, который был секвенирован. Эта работа была завершена Фредом Сэнгером и его командой в 1977 году. В 1962 году Уолтер Файерс и Роберт Синсхаймер уже продемонстрировали физическую, ковалентно замкнутую круговую структуру ДНК ΦX174. Нобелевский лауреат Артур Корнберг использовал ΦX174 в качестве модели, чтобы впервые доказать, что ДНК, синтезированная в пробирке с помощью очищенных ферментов, может воспроизводить все характеристики природного вируса, положив начало эпохе синтетической биологии. В 1972–1974 годах Джерард Хурвиц, Сью Уикнер и Рид Уикнер с коллегами идентифицировали гены, необходимые для производства ферментов, катализирующих превращение одноцепочечной формы вируса в двухцепочечную репликативную форму. В 2003 году группа Крейга Вентера сообщила, что геном ΦX174 стал первым, который был полностью собран in vitro из синтезированных олигонуклеотидов. Частица вируса ΦX174 также была успешно собрана in vitro. В 2012 году было показано, как его сильно перекрывающийся геном может быть полностью развернут и при этом оставаться функциональным.

Геном

Этот бактериофаг имеет одноцепочечный ДНК-геном кольцевой формы, состоящий из 5386 нуклеотидов, с положительной полярностью (+). Сейчас установлено, что ATT, вероятно, всё ещё способен производить белок в клетках E. coli, и, следовательно, этот ген может оказаться действительно необходимым. Первая половина генома ΦX174 характеризуется значительным перекрытием генов: восемь из одиннадцати генов перекрываются как минимум на один нуклеотид.

Транскриптом

В 2020 году был получен транскриптом ΦX174. Характерной особенностью транскриптома ΦX174 является наличие последовательности из до четырех относительно слабых промоторов, соединенных последовательно с до четырьмя Rho-независимыми (внутренними) терминаторами и одним Rho-зависимым терминатором.

Протеома

Недавно было сообщено об идентификации всех белков ΦX174 методом масс-спектрометрии.

Цикл инфекции

Инфекция начинается, когда G-белок связывается с липополисахаридами на поверхности бактериальной клетки-хозяина. H-белок (или ДНК-пилотный белок) направляет вирусный геном через бактериальную мембрану бактерий *E. coli*, скорее всего, через предсказанную N-концевую трансмембранную доменную спираль. Однако стало очевидно, что H-белок является многофункциональным белком. Это единственный вирусный капсидный белок ΦX174, для которого отсутствует кристаллическая структура по нескольким причинам. Он имеет низкое содержание ароматических аминокислот и высокое содержание глицина, что делает структуру белка очень гибкой, и, кроме того, отдельные атомы водорода (R-группы для глицинов) трудно обнаружить в рентгеноструктурном анализе белков. Кроме того, H-белок в высоких концентрациях индуцирует лизис бактериальной клетки-хозяина, поскольку предсказанная N-концевая трансмембранная спираль легко образует поры в бактериальной стенке. Биоинформатический анализ показал, что этот белок содержит четыре предсказанных домена скрученной катушки, обладающих значительной гомологией с известными факторами транскрипции. Кроме того, было установлено, что de novo синтезированный H-белок необходим для оптимального синтеза других вирусных белков. Мутации в H-белке, препятствующие включению вируса в состав вириона, могут быть преодолены при добавлении избыточного количества белка B, внутреннего каркасного белка. ДНК выбрасывается через гидрофильный канал в 5-кратной вершине. Считается, что H-белок находится в этой области, но экспериментальные данные не подтвердили его точное местоположение. Попав внутрь бактерии-хозяина, репликация генома [+] одноцепочечной ДНК происходит через промежуточный продукт – ДНК с отрицательным смыслом. Это происходит, поскольку фаговый геном суперспирализуется, а вторичная структура, образованная в результате суперспирализации, привлекает комплекс белков примосомы. Этот комплекс перемещается один раз вокруг генома и синтезирует [−] одноцепочечную ДНК из положительного исходного генома. Геномы [+] одноцепочечной ДНК, предназначенные для упаковки в вирусы, образуются посредством механизма вращающегося круга. Этот механизм заключается в том, что двухцепочечный суперспирализованный геном разрезается на положительной цепи вирусным белком А, который также привлекает бактериальную ДНК-полимеразу (ДНКП) к месту разреза. ДНКП использует отрицательную цепь в качестве матрицы для синтеза положительной цепи ДНК. По мере перемещения вокруг генома он вытесняет внешнюю цепь уже синтезированной ДНК, которая немедленно покрывается белками SSBP. Белок А разрезает весь геном каждый раз, когда распознает последовательность начала репликации. Поскольку транскрипт гена D является наиболее распространенным, этот белок является наиболее распространенным в вирусном прокапсиде. Аналогично, транскрипты генов F, J и G более многочисленны, чем транскрипт гена H, поскольку стехиометрия этих структурных белков составляет 5:5:5:1. Примосомы – это белковые комплексы, которые прикрепляют/связывают фермент геликаза с матрицей. Примосомы предоставляют РНК-праймеры для синтеза ДНК на цепях.

Infection begins when G protein binds to lipopolysaccharides on the bacterial host cell surface. H protein (or the DNA Pilot Protein) pilots the viral genome through the bacterial membrane of E. coli bacteria most likely via a predicted N terminal transmembrane domain helix. However, it has become apparent that H protein is a multifunctional protein. This is the only viral capsid protein of ΦX174 to lack a crystal structure for a couple of reasons. It has low aromatic content and high glycine content, making the protein structure very flexible and in addition, individual hydrogen atoms (the R group for glycines) are difficult to detect in protein crystallography. Additionally, H protein induces lysis of the bacterial host at high concentrations as the predicted N terminal transmembrane helix easily pokes holes through the bacterial wall. By bioinformatics, this protein contains four predicted coiled coil domains which has a significant homology to known transcription factors. Additionally, it was determined that de novo H protein was required for optimal synthesis of other viral proteins. Mutations in H protein that prevent viral incorporation, can be overcome when excess amounts of protein B, the internal scaffolding protein, are supplied. The DNA is ejected through a hydrophilic channel at the 5 fold vertex. It is understood that H protein resides in this area but experimental evidence has not verified its exact location. Once inside the host bacterium, replication of the [+] ssDNA genome proceeds via negative sense DNA intermediate. This is done as the phage genome supercoils and the secondary structure formed by such supercoiling attracts a primosome protein complex. This translocates once around the genome and synthesizes a [−]ssDNA from the positive original genome. [+]ssDNA genomes to package into viruses are created from this by a rolling circle mechanism. This is the mechanism by which the double stranded supercoiled genome is nicked on the positive strand by a virus encoded A protein, also attracting a bacterial DNA polymerase (DNAP) to the site of cleavage. DNAP uses the negative strand as a template to make positive sense DNA. As it translocates around the genome it displaces the outer strand of already synthesised DNA, which is immediately coated by SSBP proteins. The A protein cleaves the complete genome every time it recognises the origin sequence. As D protein is the most abundant gene transcript, it is the most protein in the viral procapsid. Similarly, gene transcripts for F, J, and G are more abundant than for H as the stoichiometry for these structural proteins is 5:5:5:1. The primosomes are protein complexes which attach/bind the enzyme helicase on the template. Primosomes gives RNA primers for DNA synthesis to strands.

Филогенетика и разнообразие

ΦX174 тесно связан с другими микровирусами, в особенности с фагами NC (например, NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51 и др.), и более отдалённо связан с фагами, подобными G4, и ещё более отдалённо – с фагами, подобными α3. Рокита и соавторы в 2006 году представили филогенетическое дерево, отражающее их родственные связи.

Экспериментальная эволюция

ΦX174 использовался в качестве модельного организма во многих эволюционных экспериментах.

Биотехнология

ΦX174 регулярно используется в качестве положительного контроля при секвенировании ДНК благодаря относительно небольшому размеру его генома по сравнению с другими организмами, а также относительно сбалансированному нуклеотидному составу — примерно 23% G, 22% C, 24% A и 31% T, то есть 45% G+C и 55% A+T (см. номер доступа NC 001422.1). Один запуск секвенирования Illumina может покрыть геном ΦX174 несколько миллионов раз, что делает его, вероятно, самым часто секвенированным геномом в истории. ΦX174 также используется для тестирования устойчивости средств индивидуальной защиты к вирусам, передающимся с кровью. Кроме того, ΦX174 был модифицирован для обеспечения отображения пептидов (фагового дисплея) с вирусного капсидного белка G.

Синтетическая биология

Геном ΦX174 был первым фагом, клонированным в дрожжах, и первым геномом, который был полностью расшифрован с удалением всех перекрывающихся генов. Эти изменения привели к значительному снижению адгезии к клетке-хозяину, нарушению регуляции экспрессии белков и повышенной чувствительности к нагреванию.