Изоэлектрическая точка: определение и применение.

Введение

Изоэлектрическая точка (pI, pH(I), IEP) — это pH, при котором конкретная молекула или поверхность данного твердого тела не несет чистого электрического заряда. Изоэлектрическая точка является pH, при котором молекула в статистическом среднем электрически нейтральна. Стандартная номенклатура для обозначения изоэлектрической точки — pH(I). Однако также используется pI. Для краткости в данной статье используется pI. На чистый заряд молекулы влияет pH окружающей среды, и он может становиться более положительным или отрицательным в зависимости от приобретения или потери протонов (H+), соответственно. Поверхности естественным образом заряжаются, формируя двойной слой. В типичном случае, когда ионы, определяющие поверхностный заряд, — это H+/HO−, на чистый поверхностный заряд влияет pH жидкости, в которую погружено твердое вещество. Значение pI может влиять на растворимость молекулы при заданном pH. Такие молекулы имеют минимальную растворимость в воде или солевых растворах при pH, соответствующем их pI, и часто выпадают в осадок. Биологические амфотерные молекулы, такие как белки, содержат как кислотные, так и основные функциональные группы. Аминокислоты, составляющие белки, могут быть положительными, отрицательными, нейтральными или полярными, и вместе они определяют общий заряд белка. При pH ниже их pI белки несут чистый положительный заряд; при pH выше их pI — чистый отрицательный заряд. Таким образом, белки можно разделить по чистому заряду в полиакриламидном геле с использованием либо препаративного нативного ПАГЭ, который использует постоянное pH для разделения белков, либо изоэлектрического фокусирования, которое использует градиент pH для разделения белков. Изоэлектрическое фокусирование также является первым этапом в двумерном гелевом электрофорезе полиакриламидного геля. В биомолекулах белки можно разделить с помощью ионно-обменной хроматографии. Биологические белки состоят из цвиттерионных аминокислотных соединений; чистый заряд этих белков может быть положительным или отрицательным в зависимости от pH среды. Специфический pI целевого белка можно использовать для моделирования процесса, а затем соединение можно очистить от остальной смеси. Для этого процесса очистки можно использовать буферы с различным pH для изменения pH среды. Когда смесь, содержащая целевой белок, загружается в ионообменник, стационарная матрица может быть либо положительно заряжена (для подвижных анионов), либо отрицательно заряжена (для подвижных катионов). При низких значениях pH чистый заряд большинства белков в смеси положительный — в катионных обменниках эти положительно заряженные белки связываются с отрицательно заряженной матрицей. При высоких значениях pH чистый заряд большинства белков отрицательный, и они связываются с положительно заряженной матрицей в анионных обменниках. Когда pH среды равен pI белка, чистый заряд равен нулю, и белок не связан ни с одним обменником, следовательно, может быть элюирован.

pH at which a particular molecule, or the surface of a given solid, carries no net electrical charge
The isoelectric point (pI, pH(I), IEP), is the pH at which a molecule carries no net electrical charge or is electrically neutral in the statistical mean. The standard nomenclature to represent the isoelectric point is pH(I). However, pI is also used. For brevity, this article uses pI. The net charge on the molecule is affected by pH of its surrounding environment and can become more positively or negatively charged due to the gain or loss, respectively, of protons (H+). Surfaces naturally charge to form a double layer. In the common case when the surface charge determining ions are H+/HO−, the net surface charge is affected by the pH of the liquid in which the solid is submerged. The pI value can affect the solubility of a molecule at a given pH. Such molecules have minimum solubility in water or salt solutions at the pH that corresponds to their pI and often precipitate out of solution. Biological amphoteric molecules such as proteins contain both acidic and basic functional groups. Amino acids that make up proteins may be positive, negative, neutral, or polar in nature, and together give a protein its overall charge. At a pH below their pI, proteins carry a net positive charge; above their pI they carry a net negative charge. Proteins can, thus, be separated by net charge in a polyacrylamide gel using either preparative native PAGE, which uses a constant pH to separate proteins, or isoelectric focusing, which uses a pH gradient to separate proteins. Isoelectric focusing is also the first step in 2 D gel polyacrylamide gel electrophoresis. In biomolecules, proteins can be separated by ion exchange chromatography. Biological proteins are made up of zwitterionic amino acid compounds; the net charge of these proteins can be positive or negative depending on the pH of the environment. The specific pI of the target protein can be used to model the process around and the compound can then be purified from the rest of the mixture. Buffers of various pH can be used for this purification process to change the pH of the environment. When a mixture containing a target protein is loaded into an ion exchanger, the stationary matrix can be either positively charged (for mobile anions) or negatively charged (for mobile cations). At low pH values, the net charge of most proteins in the mixture is positive – in cation exchangers, these positively charged proteins bind to the negatively charged matrix. At high pH values, the net charge of most proteins is negative, where they bind to the positively charged matrix in anion exchangers. When the environment is at a pH value equal to the protein's pI, the net charge is zero, and the protein is not bound to any exchanger, and therefore, can be eluted out.

Расчет pI-значений

Для аминокислоты, содержащей только одну амино- и одну карбоксильную группу, изоэлектрическую точку (pI) можно рассчитать как среднее значение pKa этой молекулы. pH электрофоретического геля определяется буфером, используемым для этого геля. Если pH буфера выше pI белка, белок будет мигрировать к положительному полюсу (отрицательно заряженные ионы притягиваются к положительному полюсу). Если pH буфера ниже pI белка, белок будет мигрировать к отрицательному полюсу геля (положительно заряженные ионы притягиваются к отрицательному полюсу). Если белок подвергается электрофорезу в буфере с pH, равным pI, он не будет мигрировать. Это также справедливо и для отдельных аминокислот.

Пептиды и белки

Разработан ряд алгоритмов для оценки изоэлектрических точек пептидов и белков. Большинство из них используют уравнение Хендерсона–Хассельбалха с различными значениями pK. Например, в модели, предложенной Bjellqvist и соавторами, значения pK определялись между близкородственными изофокальными точками путем фокусирования одной и той же пробы в перекрывающихся градиентах pH. Также были предложены некоторые улучшения в методологии (особенно в определении значений pK для модифицированных аминокислот). Более продвинутые методы учитывают влияние соседних аминокислот на расстоянии ±3 остатков от заряженной аспартатной или глутаминовой кислоты, влияние на свободный C-терминал, а также применяют корректирующий член к соответствующим значениям pK с использованием генетического алгоритма. Другие современные подходы основаны на алгоритме опорных векторов и оптимизации pKa по отношению к экспериментально известным изоэлектрическим точкам белков/пептидов. Кроме того, экспериментально измеренные изоэлектрические точки белков были собраны в базы данных. Недавно была разработана также база данных изоэлектрических точек для всех белков, предсказанных с использованием большинства доступных методов. На практике белок с избытком основных аминокислот (аргинин, лизин и/или гистидин) будет иметь изоэлектрическую точку примерно выше 7 (щелочная), в то время как белок с избытком кислых аминокислот (аспартатная кислота и/или глутаминовая кислота) часто будет иметь изоэлектрическую точку ниже 7 (кислотная). Электрофоретическое линейное (горизонтальное) разделение белков по Ip вдоль градиента pH в полиакриламидном геле (также известном как изоэлектрическое фокусирование), за которым следует стандартное линейное (вертикальное) разделение по молекулярной массе во втором полиакриламидном геле (SDS-PAGE), составляет так называемый двумерный гель-электрофорез или PAGE 2D. Эта техника позволяет тщательно разделить белки в виде отдельных "пятен", при этом белки с высокой молекулярной массой и низким Ip мигрируют в верхнюю левую часть двумерного геля, а белки с низкой молекулярной массой и высоким Ip – в нижнюю правую область того же геля.

A number of algorithms for estimating isoelectric points of peptides and proteins have been developed. Most of them use Henderson–Hasselbalch equation with different pK values. For instance, within the model proposed by Bjellqvist and co workers, the pKs were determined between closely related immobilines by focusing the same sample in overlapping pH gradients. Some improvements in the methodology (especially in the determination of the pK values for modified amino acids) have been also proposed. More advanced methods take into account the effect of adjacent amino acids ±3 residues away from a charged aspartic or glutamic acid, the effects on free C terminus, as well as they apply a correction term to the corresponding pK values using genetic algorithm. Other recent approaches are based on a support vector machine algorithm and pKa optimization against experimentally known protein/peptide isoelectric points. Moreover, experimentally measured isoelectric point of proteins were aggregated into the databases. Recently, a database of isoelectric points for all proteins predicted using most of the available methods had been also developed. In practice, a protein with an excess of basic aminoacids (arginine, lysine and/or histidine) will bear an isoelectric point roughly greater than 7 (basic), while a protein with an excess of acidic aminoacids (aspartic acid and/or glutamic acid) will often have an isoelectric point lower than 7 (acidic). The electrophoretic linear (horizontal) separation of proteins by Ip along a pH gradient in a polyacrylamide gel (also known as isoelectric focusing), followed by a standard molecular weight linear (vertical) separation in a second polyacrylamide gel (SDS PAGE), constitutes the so called two dimensional gel electrophoresis or PAGE 2D. This technique allows a thorough separation of proteins as distinct "spots", with proteins of high molecular weight and low Ip migrating to the upper left part of the bidimensional gel, while proteins with low molecular weight and high Ip locate to the bottom right region of the same gel.

По сравнению с точкой нулевого заряда

Термины изоэлектрическая точка (IEP) и точка нулевого заряда (PZC) часто используются как взаимозаменяемые, хотя в определенных случаях может быть полезно проводить различие. В системах, где H+/OH− являются ионами, определяющими потенциал на границе раздела фаз, точка нулевого заряда выражается через pH. pH, при котором поверхность демонстрирует нейтральный суммарный электрический заряд, и является точкой нулевого заряда на поверхности. Электрокинетические явления обычно измеряют дзета-потенциал, а нулевой дзета-потенциал интерпретируется как точка нулевого суммарного заряда на плоскости сдвига. Это и называется изоэлектрической точкой. Таким образом, изоэлектрическая точка – это значение pH, при котором коллоидная частица остается неподвижной в электрическом поле. Ожидается, что изоэлектрическая точка будет несколько отличаться от точки нулевого заряда на поверхности частицы, но это различие часто игнорируется на практике для так называемых «чистых» поверхностей, то есть поверхностей, не имеющих специфически адсорбированных положительных или отрицательных зарядов. При отсутствии положительных или отрицательных зарядов поверхность лучше всего описывается точкой нулевого заряда. Если положительные и отрицательные заряды присутствуют в равных количествах, то это и есть изоэлектрическая точка. Таким образом, PZC относится к отсутствию любого типа поверхностного заряда, в то время как IEP относится к состоянию нейтрального суммарного поверхностного заряда. Разница между ними, следовательно, заключается в количестве заряженных центров в точке нулевого суммарного заряда. Жоливе использует внутренние константы равновесия поверхности, pK− и pK+, чтобы определить эти два состояния с точки зрения относительного числа заряженных центров:

Для больших ΔpK (>4 по Жоливе), преобладающим видом является MOH, при этом количество заряженных видов относительно невелико – поэтому PZC актуальна. Для малых значений ΔpK существует большое количество заряженных видов, примерно в равных пропорциях, поэтому говорят об IEP.