Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Этанолды тұндыру – сулы ерітінділерден РНК, ДНК және пектин, ксилоглюкан сияқты полисахаридтерді этанолды антиеріткіш ретінде қосу арқылы тазарту және/немесе шоғырландыру әдісі.
Ethanol precipitation is a method used to purify and/or concentrate RNA, DNA, and polysaccharides such as pectin and xyloglucan from aqueous solutions by adding ethanol as an antisolvent.
Практика
ДНК тұндыру үшін алдымен ерітіндіде оң иондардың дұрыс концентрациясы болуын қамтамасыз ету қажет (көп болса ДНК-мен бірге көп тұз тұндырылып қалады, ал аз болса ДНК толық қалпына келмейді), содан кейін кемінде 95% этанолдан екі-үш есе көбірек қосу керек. Көптеген хаттамалар осы кезде ДНК-ны төмен температурада сақтауға кеңес береді, бірақ ДНК-ның қалпына келуін жақсартпауы мүмкін, тіпті түнгі инкубация уақытын пайдаланса, тұндыру тиімділігі төмендеуі мүмкін. Сондықтан бөлме температурасында да тиімділікке қол жеткізуге болады, бірақ ыдырау мүмкіндігін ескергенде, ДНК-ны мұзда инкубациялау артық болмас. Инкубация уақытының оңтайлы ұзақтығы ДНК-ның ұзындығы мен концентрациясына байланысты. Кішкентай фрагменттер мен төмен концентрациялар үшін қанағаттанарлық қалпына келтіруге ұзақ уақыт қажет. Өте кішкентай фрагменттер мен төмен концентрациялар үшін түнгі инкубация ұсынылады. Мұндай жағдайларда tRNA, гликоген немесе сызықтық полиакриламид сияқты тасымалдаушыларды қолдану қалпына келтіруді едәуір жақсарта алады. Инкубация кезінде ерітіндіден ДНК және кейбір тұздар тұнбаланады, ал келесі қадамда бұл тұнба микроцентрифуга түтігінде жоғары жылдамдықпен (~12 000g) центрифугалау арқылы жиналады. Центрифугалау уақыты мен жылдамдығы ДНК-ның қалпына келу деңгейіне ең үлкен әсер етеді. Кішкентай фрагменттер мен жоғары сұйытылған ерітінділер үшін ұзақ және жылдам центрифугалау қажет. Центрифугалау бөлме температурасында немесе 4 °C немесе 0 °C температурада жүргізілуі мүмкін. Центрифугалау кезінде тұнған ДНК этанол ерітіндісі арқылы түтіктің түбіне қарай жылжуы керек, төмен температура ерітіндінің тұтқырлығын арттырады және үлкен көлемдер қашықтықты ұзартады, сондықтан бұл екі фактор да процестің тиімділігін төмендетеді, демек бірдей нәтижеге қол жеткізу үшін ұзақ центрифугалау қажет. Центрифугалаудан кейін үстіңгі ерітінді алынып тасталады, ал түбінде шикі ДНК тұнбасы қалады. Тұнбаның көрінуі ДНК мөлшеріне және оның тазалығына (ластанған тұнбаны көру оңайырақ) немесе ко-тұндырғыштардың қолданылуына байланысты. Келесі қадамда 70% этанол тұнбаға қосылады, ақырын араластырылып, тұнбаны бөліп, жуу үшін қолданылады. Бұл қалған үстіңгі ерітіндідегі тұздардың бір бөлігін және ДНК тұнбасына байланысқан тұздарды жояды, соның нәтижесінде ДНК тазаланады. Бұл суспензия тағы да центрифугаланады, ДНК тағы да тұнбаланады және үстіңгі ерітінді алынып тасталады. Бұл қадам бір рет қайталанады. Соңында, тұнба ауада кептіріліп, ДНК суға немесе басқа қажетті буферге қайта ерітіледі. Тұнбаны тым кептірмеу керек, өйткені бұл ДНК денатурациялануына және қайта ерітуді қиындатуына әкелуі мүмкін. Этанолдың орнына изопропанол да қолдануға болады, изопропанолдың тұндыру тиімділігі жоғарырақ, сондықтан тұндыру үшін бір көлем жеткілікті. Алайда изопропанол этанолға қарағанда аз ұшпалы және соңғы қадамда ауада кептіру үшін көбірек уақыт қажет. Изопропанол қолданғанда тұнба түтікке аз жабысуы мүмкін.
DNA is precipitated by first ensuring that the correct concentration of positive ions is present in solution (too much will result in a lot of salt co precipitating with DNA, too little will result in incomplete DNA recovery) and then adding two to three volumes of at least 95% ethanol. Many protocols advise storing DNA at low temperature at this point, but there are also observations that it may not improve DNA recovery, and may even lower precipitation efficiency while using over night incubation time. Therefore, good efficiency can be achieved at room temperature, but when possible degradation is taken into account, it is probably better to incubate DNA on wet ice. Optimal incubation time depends on the length and concentration of DNA. Smaller fragments and lower concentrations will require longer times to achieve acceptable recovery. For very small lengths and low concentrations over night incubation is recommended. In such cases use of carriers like tRNA, glycogen or linear polyacrylamide can greatly improve recovery. During incubation DNA and some salts will precipitate from solution, in the next step this precipitate is collected by centrifugation in a microcentrifuge tube at high speeds (~12,000g). Time and speed of centrifugation has the biggest effect on DNA recovery rates. Again smaller fragments and higher dilutions require longer and faster centrifugation. Centrifugation can be done either at room temperature or in 4 °C or 0 °C. During centrifugation precipitated DNA has to move through ethanol solution to the bottom of the tube, lower temperatures increase viscosity of the solution and larger volumes make the distance longer, so both those factors lower efficiency of this process requiring longer centrifugation for the same effect. After centrifugation the supernatant solution is removed, leaving a pellet of crude DNA. Whether the pellet is visible depends on the amount of DNA and on its purity (dirtier pellets are easier to see) or the use of co precipitants. In the next step, 70% ethanol is added to the pellet, and it is gently mixed to break the pellet loose and wash it. This removes some of the salts present in the leftover supernatant and bound to DNA pellet making the final DNA cleaner. This suspension is centrifuged again to once again pellet DNA and the supernatant solution is removed. This step is repeated once. Finally, the pellet is air dried and the DNA is resuspended in water or other desired buffer. It is important not to over dry the pellet as it may lead to denaturation of DNA and make it harder to resuspend. Isopropanol can also be used instead of ethanol; the precipitation efficiency of the isopropanol is higher making one volume enough for precipitation. However, isopropanol is less volatile than ethanol and needs more time to air dry in the final step. The pellet might also adhere less tightly to the tube when using isopropanol.