Осаждение этанолом: протокол выделения и очистки ДНК и РНК.

Введение

Осаждение этанолом — это метод, используемый для очистки и/или концентрирования РНК, ДНК и полисахаридов, таких как пектин и ксилоглюкан, из водных растворов путем добавления этанола как антирастворителя.

Практика

ДНК осаждается, сначала убедившись, что в растворе присутствует правильная концентрация положительных ионов (слишком много приведет к соосаждению большого количества соли с ДНК, слишком мало – к неполному восстановлению ДНК), а затем добавив два-три объема не менее 95% этанола. Многие протоколы рекомендуют хранить ДНК при низкой температуре на этом этапе, но есть данные, что это может не улучшить восстановление ДНК и даже снизить эффективность осаждения при использовании ночной инкубации. Поэтому хорошей эффективности можно достичь при комнатной температуре, но, учитывая возможную деградацию, вероятно, лучше инкубировать ДНК на мокром льду. Оптимальное время инкубации зависит от длины и концентрации ДНК. Для небольших фрагментов и низких концентраций потребуется больше времени для достижения приемлемого восстановления. Для очень коротких фрагментов и низких концентраций рекомендуется ночная инкубация. В таких случаях использование носителей, таких как тРНК, гликоген или линейный полиакриламид, может значительно улучшить восстановление. Во время инкубации ДНК и некоторые соли осаждаются из раствора, на следующем этапе этот осадок собирается центрифугированием в микроцентрифужной пробирке при высоких скоростях (~12 000g). Время и скорость центрифугирования оказывают наибольшее влияние на скорость восстановления ДНК. Опять же, для небольших фрагментов и высоких разведений требуется более длительное и быстрое центрифугирование. Центрифугирование можно проводить при комнатной температуре или при 4 °C или 0 °C. Во время центрифугирования осажденная ДНК должна перемещаться через раствор этанола к дну пробирки. Более низкие температуры увеличивают вязкость раствора, а большие объемы – расстояние, поэтому оба этих фактора снижают эффективность процесса, требуя более длительного центрифугирования для достижения того же эффекта. После центрифугирования надосадочная жидкость удаляется, оставляя осадок неочищенной ДНК. Видимость осадка зависит от количества ДНК и ее чистоты (более загрязненные осадки легче увидеть) или от использования соосадителей. На следующем этапе к осадку добавляют 70% этанол и аккуратно перемешивают, чтобы разбить осадок и промыть его. Это удаляет часть солей, присутствующих в оставшейся надосадочной жидкости и связанных с осадком ДНК, делая конечную ДНК чище. Эта суспензия снова центрифугируется для повторного осаждения ДНК, и надосадочная жидкость удаляется. Этот шаг повторяют один раз. Наконец, осадок высушивают на воздухе, а ДНК ресуспендируют в воде или другом желаемом буфере. Важно не пересушить осадок, так как это может привести к денатурации ДНК и затруднить ее ресуспендирование. Изопропанол также можно использовать вместо этанола; эффективность осаждения изопропанола выше, что позволяет использовать один объем для осаждения. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и требует больше времени для высушивания на воздухе на последнем этапе. Осадок также может хуже прилипать к стенкам пробирки при использовании изопропанола.

DNA is precipitated by first ensuring that the correct concentration of positive ions is present in solution (too much will result in a lot of salt co precipitating with DNA, too little will result in incomplete DNA recovery) and then adding two to three volumes of at least 95% ethanol. Many protocols advise storing DNA at low temperature at this point, but there are also observations that it may not improve DNA recovery, and may even lower precipitation efficiency while using over night incubation time. Therefore, good efficiency can be achieved at room temperature, but when possible degradation is taken into account, it is probably better to incubate DNA on wet ice. Optimal incubation time depends on the length and concentration of DNA. Smaller fragments and lower concentrations will require longer times to achieve acceptable recovery. For very small lengths and low concentrations over night incubation is recommended. In such cases use of carriers like tRNA, glycogen or linear polyacrylamide can greatly improve recovery. During incubation DNA and some salts will precipitate from solution, in the next step this precipitate is collected by centrifugation in a microcentrifuge tube at high speeds (~12,000g). Time and speed of centrifugation has the biggest effect on DNA recovery rates. Again smaller fragments and higher dilutions require longer and faster centrifugation. Centrifugation can be done either at room temperature or in 4 °C or 0 °C. During centrifugation precipitated DNA has to move through ethanol solution to the bottom of the tube, lower temperatures increase viscosity of the solution and larger volumes make the distance longer, so both those factors lower efficiency of this process requiring longer centrifugation for the same effect. After centrifugation the supernatant solution is removed, leaving a pellet of crude DNA. Whether the pellet is visible depends on the amount of DNA and on its purity (dirtier pellets are easier to see) or the use of co precipitants. In the next step, 70% ethanol is added to the pellet, and it is gently mixed to break the pellet loose and wash it. This removes some of the salts present in the leftover supernatant and bound to DNA pellet making the final DNA cleaner. This suspension is centrifuged again to once again pellet DNA and the supernatant solution is removed. This step is repeated once. Finally, the pellet is air dried and the DNA is resuspended in water or other desired buffer. It is important not to over dry the pellet as it may lead to denaturation of DNA and make it harder to resuspend. Isopropanol can also be used instead of ethanol; the precipitation efficiency of the isopropanol is higher making one volume enough for precipitation. However, isopropanol is less volatile than ethanol and needs more time to air dry in the final step. The pellet might also adhere less tightly to the tube when using isopropanol.