Протокол тоқ нүктелі блоттинг (dot blot) – протеин анықтаудың жылдам әдісі. Электрофорезсіз, тікелей мембранаға жағылады. Жылдам, бірақ протеин мөлшері туралы ақпарат бермейді.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Тоқ нүктесі (немесе тесік нүктесі) – молекулалық биологияда ақуыздарды анықтауға қолданылатын әдіс. Бұл батыс блот әдісін жеңілдетілген нұсқасы болып табылады, ерекшелігі – анықталуға тиіс ақуыздарды алдымен электрофорез арқылы бөліп алмайды. Оның орнына, сынама бір нүктеде мембранаға тікелей жағылады, содан кейін блоттау процедурасы орындалады. Бұл әдіс хроматография немесе гель электрофорезі сияқты процедураларды және гельге блоттаудың күрделі кезеңдерін қажет етпейтіндіктен, уақытты үнемдеуге мүмкіндік береді. Дегенмен, бұл әдіс анықталатын ақуыздың мөлшері туралы ақпаратты қамтамасыз етпейді.
A dot blot (or slot blot) is a technique in molecular biology used to detect proteins. It represents a simplification of the western blot method, with the exception that the proteins to be detected are not first separated by electrophoresis. Instead, the sample is applied directly on a membrane in a single spot, and the blotting procedure is performed. The technique offers significant savings in time, as chromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required. However, it offers no information on the size of the target protein.
Қолданылуы
Доттық сызықты жасау, батыс сызығын жасау сияқты идеяға негізделген, бірақ одан жылдам және төмен құнмен жасалады. Доттық сызықтар антидененің байланысу мүмкіндіктерін анықтау үшін де қолданылады.
Performing a dot blot is similar in idea to performing a western blot, with the advantage of faster speed and lower cost. Dot blots are also performed to screen the binding capabilities of an antibody.
Әдістер
Жалпы нүктелі протокол 1–2 микролитр үлгіні нитроцеллюлоза немесе ПВДФ мембранасына тамшылап, ауада кептіруді қамтиды. Үлгілер ұлпа мәдениетінің сұйықтықтары, қан сарысуы, жасушалардың экстракттары немесе басқа да дайындықтар түрінде болуы мүмкін. Антиденелердің арнайы емес байланысын болдырмау үшін мембрананы блоктау буферінде инкубациялайды. Одан кейін оны бірінші антиденемен, одан кейін анықтау антиденесімен немесе анықтау молекуласына (көбінесе HRP немесе сілтілік фосфатаза) қосылған бірінші антиденемен инкубациялайды. Антиденелер байланысқаннан кейін мембрананы химилюминесцентті субстратпен инкубациялап, суреттейді.
A general dot blot protocol involves spotting 1–2 microliters of a samples onto a nitrocellulose or PVDF membrane and letting it air dry. Samples can be in the form of tissue culture supernatants, blood serum, cell extracts, or other preparations. The membrane is incubated in blocking buffer to prevent non specific binding of antibodies. It is then incubated with a primary antibody followed by a detection antibody or a primary antibody conjugated to a detection molecule (commonly HRP or alkaline phosphatase). After antibody binding, the membrane is incubated with a chemiluminescent substrate and imaged.
Құрылғы
Тоқалдату әдетте нитроцеллюлоза немесе ПВДФ мембранасының бір бөлігінде жүргізіледі. Ақуыз үлгілері мембранаға тамшылатылғаннан кейін, мембрана пластикалық контейнерге салынып, блоктандырғыш буферде, антидене ерітіндісінде немесе шаю буферінде шағылыстырып инкубацияланады. Химиялюминесценциялық бейнелеу үшін мембрананың бір бөлігі фермент субстратымен толтырылған мөлдір пластикалық пленкаға оралуы керек. Вакуумдық көмекпен тоқалдату аппараты, мембрананың астынан ерітіндіні сору арқылы жуу және инкубациялау процесін жеңілдетуге қолданылады, ол бірнеше қабатты пластиналар арасында жиналады, бұл үлгі ұялары арасында жақсы тығыздалуды қамтамасыз етеді, қалдық ерітіндіні жинап, сору күшін жеткізеді. Химиялюминесценциялық сигналды анықтау үшін аппаратты бөлшектеп, мембрананы алып, мөлдір пластикалық пленкаға орау қажет.
Dot blot is conventionally performed on a piece of nitrocellulose membrane or PVDF membrane. After the protein samples are spotted onto the membrane, the membrane is placed in a plastic container and sequentially incubated in blocking buffer, antibody solutions, or rinsing buffer on shaker. Finally, for chemiluminescence imaging, the piece of membrane need to be wrapped in a transparent plastic film filled with enzyme substrate. Vacuum assisted dot blot apparatus has been used to facilitate the rinsing and incubating process by using vacuum to extract the solution from underneath the membrane, which is assembled in between several layers of plates to ensure good seal between sample wells, hold waste solution, and deliver suction force. For chemiluminescence signal detection, apparatus need to be disassembled and the membrane need to be taken out and wrapped in a transparent plastic film.