Дот-блот: быстрый и экономичный метод детекции белков.
Dot blot
Дот-блот: быстрый метод обнаружения белков в молекулярной биологии. Альтернатива вестерн-блоту без электрофореза. Экономия времени, но без определения размера белка.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Точечный блот (или слот-блот) — это метод в молекулярной биологии, используемый для обнаружения белков. Он представляет собой упрощение метода вестерн-блот, за исключением того, что белки, подлежащие обнаружению, предварительно не разделяются электрофорезом. Вместо этого образец наносится непосредственно на мембрану в виде одной точки, после чего выполняется процедура блоттинга. Этот метод позволяет значительно сэкономить время, поскольку не требуется хроматография или гель-электрофорез, а также сложные процедуры переноса с геля. Однако он не предоставляет информации о размере целевого белка.
A dot blot (or slot blot) is a technique in molecular biology used to detect proteins. It represents a simplification of the western blot method, with the exception that the proteins to be detected are not first separated by electrophoresis. Instead, the sample is applied directly on a membrane in a single spot, and the blotting procedure is performed. The technique offers significant savings in time, as chromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required. However, it offers no information on the size of the target protein.
Применение
Выполнение дот-блота по принципу схоже с вестерн-блотом, но имеет преимущество в скорости и более низкой стоимости. Дот-блот также используется для оценки способности антитела к связыванию.
Performing a dot blot is similar in idea to performing a western blot, with the advantage of faster speed and lower cost. Dot blots are also performed to screen the binding capabilities of an antibody.
Методы
Общий протокол dot blot включает в себя нанесение 1–2 микролитров образца на мембрану из нитроцеллюлозы или PVDF и высушивание на воздухе. Образцы могут быть представлены в виде сред клеток в культуре, сыворотки крови, клеточных экстрактов или других препаратов. Мембрана инкубируется в блокирующем буфере для предотвращения неспецифического связывания антител. Затем ее инкубируют с первичным антителом, за которым следует детекционное антитело или первичное антитело, конъюгированное с молекулой для детекции (обычно HRP или щелочной фосфатазой). После связывания антител мембрану инкубируют с химилюминесцентным субстратом и визуализируют.
A general dot blot protocol involves spotting 1–2 microliters of a samples onto a nitrocellulose or PVDF membrane and letting it air dry. Samples can be in the form of tissue culture supernatants, blood serum, cell extracts, or other preparations. The membrane is incubated in blocking buffer to prevent non specific binding of antibodies. It is then incubated with a primary antibody followed by a detection antibody or a primary antibody conjugated to a detection molecule (commonly HRP or alkaline phosphatase). After antibody binding, the membrane is incubated with a chemiluminescent substrate and imaged.
Аппаратура
Точечный блот обычно выполняется на кусочке нитроцеллюлозной или ПВДФ-мембраны. После нанесения образцов белка на мембрану, мембрану помещают в пластиковый контейнер и последовательно инкубируют в блокирующем буфере, растворах антител или промывочном буфере на шейкере. Наконец, для химилюминесцентной визуализации кусок мембраны необходимо обернуть прозрачной пластиковой пленкой, содержащей ферментный субстрат. Для облегчения процесса промывки и инкубации используется вакуумный аппарат для точечного блота, который удаляет раствор из-под мембраны, собранной между несколькими слоями пластин, обеспечивающих герметичность между лунками для образцов, удержание отработанного раствора и создание силы всасывания. Для регистрации химилюминесцентного сигнала необходимо разобрать аппарат и извлечь мембрану, после чего ее следует обернуть прозрачной пластиковой пленкой.
Dot blot is conventionally performed on a piece of nitrocellulose membrane or PVDF membrane. After the protein samples are spotted onto the membrane, the membrane is placed in a plastic container and sequentially incubated in blocking buffer, antibody solutions, or rinsing buffer on shaker. Finally, for chemiluminescence imaging, the piece of membrane need to be wrapped in a transparent plastic film filled with enzyme substrate. Vacuum assisted dot blot apparatus has been used to facilitate the rinsing and incubating process by using vacuum to extract the solution from underneath the membrane, which is assembled in between several layers of plates to ensure good seal between sample wells, hold waste solution, and deliver suction force. For chemiluminescence signal detection, apparatus need to be disassembled and the membrane need to be taken out and wrapped in a transparent plastic film.