Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
X галь (сонымен қатар 5 бром 4 хлоро 3 индолил β-галактопиранозид үшін BCIG деп қысқартылады) – галактозаға байланысқан, орны толтырылған индолдан тұратын органикалық қосылыс. Бұл қосылысты 1964 жылы Жером Хорвиц және оның әріптестері синтездеді. Формалды химиялық атауы көбінесе бромхлориндоксил галактозиді сияқты, дәл емес, бірақ қолдануға ыңғайлы тіркестермен қысқартылады. Индоксилдегі Х әрпі, X галь қысқартуындағы Х әрпінің шығу тегі болуы мүмкін. X галь молекулалық биологияда β-галактозидаза ферментінің бар-жоғын, оның әдеттегі мақсаты – β-галактозидтың орнына тексеру үшін жиі қолданылады. Сондай-ақ, бұл ферменттің активтілігін гистохимия және бактериологияда анықтау үшін де қолданылады. X галь – ферменттік катализ арқылы гидролизденгенде индиго бояуына ұқсас ерімейтін көк түсті қосылыстар беретін көптеген индоксил гликозидтері мен эфирлерінің бірі. Кем қолданылатын, бірақ өте ұқсас (хиралды) қосылыс – X галь (Xαgal, X alpha gal) немесе 5 бром 4 хлоро 3 индолил α-D-галактопиранозид, ол β-галактозидазаның (EC 3.2.1.23) орнына α-галактозидазамен (EC 3.2.1.22) гидролизденеді.
X gal (also abbreviated BCIG for 5 bromo 4 chloro 3 indolyl β galactopyranoside) is an organic compound consisting of galactose linked to a substituted indole. The compound was synthesized by Jerome Horwitz and collaborators in 1964. The formal chemical name is often shortened to less accurate but also less cumbersome phrases such as bromochloroindoxyl galactoside. The X from indoxyl may be the source of the X in the X gal contraction. X gal is often used in molecular biology to test for the presence of an enzyme, β galactosidase, in the place of its usual target, a β galactoside. It is also used to detect activity of this enzyme in histochemistry and bacteriology. X gal is one of many indoxyl glycosides and esters that yield insoluble blue compounds similar to indigo dye as a result of enzyme catalyzed hydrolysis. A less often used but very similar (chiral) compound is X gal (Xαgal, X alpha gal), or 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl α D galactopyranoside, which is hydrolyzed by α galactosidase (EC 3.2.1.22) instead of β galactosidase (EC 3.2.1.23).
Қолданылуы
X gal лактозаның аналогы болып табылады, демек лактозадағы β-гликозидтік байланысты кесетін β-галактозидаза ферментімен гидролизделген болуы мүмкін. X gal, β-галактозидазамен кесілген кезде, галактоза және 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол 1-ді шығарады. Соңғысы спонтанды түрде димеризацияланып, 5,5'-дибромо-4,4'-дихлор индиго 2-ге тотығады, бұл өте күлгін түсті, ерімейтін өнім. X gal өзі түссіз, сондықтан күлгін түсті өнімнің болуын белсенді β-галактозидазаның бар екенін анықтау үшін тест ретінде пайдалануға болады. Бұл бактериялық β-галактозидазаның (lacZ деп аталатын) әртүрлі қолданыстарда репортер ретінде қолданылуына да мүмкіндік береді. Сол сияқты, Xαgal α-галактозидаза үшін репортерлік қосылыс ретінде қолданылады (мысалы, ашытқыдағы Mel1).
X gal is an analog of lactose, and therefore may be hydrolyzed by the β galactosidase enzyme which cleaves the β glycosidic bond in lactose. X gal, when cleaved by β galactosidase, yields galactose and 5 bromo 4 chloro 3 hydroxyindole 1. The latter then spontaneously dimerizes and is oxidized into 5,5' dibromo 4,4' dichloro indigo 2, an intensely blue product which is insoluble. X gal itself is colorless, so the presence of blue colored product may therefore be used as a test for the presence of active β galactosidase. This also allows for bacterial β galactosidase (so called lacZ ) to be used as a reporter in various applications. Similarly, Xαgal is used as a reporter compound for α galactosidase (e. g. Mel1 in yeast).
Клондау
Генді клондау кезінде X gal көк/ақ скрининг деп аталатын әдісте клетканың функционалды β-галактозидаза ферментін экспрессиялайтынын визуальды түрде анықтау үшін қолданылады. Бұл скрининг әдісі сәтті клондау өнімдерін сәтті болмағандардан ажыратудың ыңғайлы тәсілі болып табылады. Көк/ақ скрининг әдісі β-галактозидаза генінің α-комплементация принципіне негізделген, онда плазмидтегі lacZ генінің (lacZα) фрагменті клеткадағы басқа мутант lacZ генін (lacZΔM15) толықтырады. Екі геннің өзі функционалды емес пептидтерді шығарады, бірақ олар бірге экспрессияланған кезде, мысалы, lacZα генін қамтитын плазмид lacZΔM15 клеткаларына трансформацияланғанда, функционалды β-галактозидаза құрайды. Активті β-галактозидазаның болуын X gal бар ортада клеткаларды өсіргенде анықтауға болады, нәтижесінде клеткалардың ішінде көк түсті өнім тұнбаға түсіп, ерекше көк колониялар пайда болады. Дегенмен, қызығушылық тудыратын генді плазмид векторына қосуға болатын көптеген клондау орындары lacZα генінің ішінде орналасқан. Сәтті лигация нәтижесінде lacZα гені бұзылады, демек α-комплементация да бұзылады және функционалды β-галактозидаза пайда бола алмайды, нәтижесінде ақ колониялар пайда болады. Сәтті лигацияланған инсерт бар клеткаларды сәтті лигацияланбаған көк клеткалардан ақ түсі арқылы оңай анықтауға болады. Бұл тест үшін қолданылатын клондау векторларының мысалдары pUC19, pBluescript, pGem T векторлары, сонымен қатар мутант lacZΔM15 генін тасымалдайтын DH5α сияқты нақты E. coli штаммдарын пайдалану қажет. Көп жағдайда X Gal бар ортаға IPTG (изопропил β 1 тиогалактопиранозид) қосылады. IPTG лактозаның химиялық құрылымына ұқсас аналог болып табылады. Алайда, IPTG β-галактозидазамен гидролизделмейді. IPTG лак репрессорына байланысып, ДНК-ны босататын және транскрипцияға мүмкіндік беретін индуктор ретінде қолданылады. Сондықтан, агар ортасында IPTG болуы β-галактозидаза синтезін арттырады.
In gene cloning, X gal is used as a visual indication of whether a cell expresses a functional β galactosidase enzyme in a technique called blue/white screening. This method of screening is a convenient way of distinguishing a successful cloning product from other unsuccessful ones. The blue/white screening method relies on the principle of α complementation of the β galactosidase gene, where a fragment of the lacZ gene (lacZα) in the plasmid can complement another mutant lacZ gene (lacZΔM15) in the cell. Both genes by themselves produce non functional peptides, however, when expressed together, as when a plasmid containing lacZα is transformed into a lacZΔM15 cells, they form a functional β galactosidase. The presence of an active β galactosidase may be detected when cells are grown in plates containing X gal, the blue colored product precipitated within cells resulted in the characteristic blue colonies. However, the multiple cloning site, where a gene of interest may be ligated into the plasmid vector, is located within the lacZα gene. Successful ligation therefore disrupts the lacZα gene, α complementation is therefore also disrupted and no functional β galactosidase can form, resulting in white colonies. Cells containing successfully ligated insert can then be easily identified by its white coloration from the unsuccessful blue ones. Example of cloning vectors used for this test are pUC19, pBluescript, pGem T Vectors, and it also requires the use of specific E. coli host strains such as DH5α which carries the mutant lacZΔM15 gene. Often, the plate containing X Gal also contains IPTG (isopropyl β 1 thiogalactopyranoside). IPTG is a chemical structure analogue of lactose. However, IPTG cannot be hydrolyzed by β galactosidase. IPTG is used as an inducer that binds to lac repressor releasing the DNA and allowing transcription. The presence of IPTG in the agar plate therefore increases the synthesis of β galactosidase.
Белсенді- белок өзара әсерлері
Екі гибридтік талдауда β-галактозидаза бір-бірімен әрекеттесетін белоктарды анықтау үшін репортер ретінде қолданылуы мүмкін. Бұл әдісте геномдық кітапханалар ашытқы немесе бактериялық жүйелерді пайдалана отырып, белоктардың өзара әрекеттесуін тексеруге болады. Егер тексеріліп жатқан белоктар арасында сәтті өзара әрекеттесу болса, ол активациялық доменнің промоторға байланысуына алып келеді. Егер промотор lacZ генімен байланысты болса, онда X-галдың қатысуында көк түсті колониялардың пайда болуына себеп болатын β-галактозидазаның өндірісі, белоктар арасындағы сәтті өзара әрекеттесуді көрсетеді. Бұл техниканың қолданылуы шамамен 106 мөлшеріндегі кітапханаларды тексерумен шектелуі мүмкін. X-галдың сәтті ыдырауы индолдың ұшқыш заттарынан туындаған жағымсыз иіске әкеледі.
In two hybrid analysis, β galactosidase may be used as a reporter to identify proteins that interact with each other. In this method, genome libraries may be screened for protein interaction using yeast or bacterial system. Where there is a successful interaction between proteins being screened, it will result to the binding of an activation domain to a promoter. If the promoter is linked to a lacZ gene, the production of β galactosidase, which results in the formation of blue pigmented colonies in the presence of X gal, will therefore indicate a successful interaction between proteins. This technique may be limited to screening libraries of size of less than around 106. The successful cleavage of X gal also creates a noticeably foul odor due to the volatilization of indole.