Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
X-галь (также сокращенно BCIG для 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-галактопиранозида) — органическое соединение, состоящее из галактозы, связанной с замещенным индолом. Соединение было синтезировано Джеромом Хорвицем и его коллегами в 1964 году. Полное химическое название часто сокращают до менее точных, но более удобных фраз, таких как бромохлороиндоксил-галактозид. Буква X в индоксиле, вероятно, является источником X в сокращении X-галь. X-галь часто используется в молекулярной биологии для определения наличия фермента β-галактозидазы вместо его обычной мишени, β-галактозида. Он также применяется для выявления активности этого фермента в гистохимии и бактериологии. X-галь является одним из многих индоксилгликозидов и эфиров, которые в результате ферментативного гидролиза образуют нерастворимые соединения синего цвета, подобные красителю индиго. Менее распространенным, но очень похожим (хиральным) соединением является X-гал (Xαgal, X-альфа-гал), или 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-галактопиранозид, который гидролизуется α-галактозидазой (EC 3.2.1.22) вместо β-галактозидазы (EC 3.2.1.23).
X gal (also abbreviated BCIG for 5 bromo 4 chloro 3 indolyl β galactopyranoside) is an organic compound consisting of galactose linked to a substituted indole. The compound was synthesized by Jerome Horwitz and collaborators in 1964. The formal chemical name is often shortened to less accurate but also less cumbersome phrases such as bromochloroindoxyl galactoside. The X from indoxyl may be the source of the X in the X gal contraction. X gal is often used in molecular biology to test for the presence of an enzyme, β galactosidase, in the place of its usual target, a β galactoside. It is also used to detect activity of this enzyme in histochemistry and bacteriology. X gal is one of many indoxyl glycosides and esters that yield insoluble blue compounds similar to indigo dye as a result of enzyme catalyzed hydrolysis. A less often used but very similar (chiral) compound is X gal (Xαgal, X alpha gal), or 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl α D galactopyranoside, which is hydrolyzed by α galactosidase (EC 3.2.1.22) instead of β galactosidase (EC 3.2.1.23).
Применение
X-галь является аналогом лактозы и, следовательно, может гидролизоваться ферментом β-галактозидазой, который расщепляет β-гликозидную связь в лактозе. При расщеплении X-галя β-галактозидазой образуются галактоза и 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол 1. Последний затем спонтанно димеризуется и окисляется до 5,5'-дибромо-4,4'-дихлориндиго 2 – интенсивно-голубого нерастворимого продукта. Поскольку сам X-галь бесцветен, наличие голубого продукта может использоваться в качестве теста на присутствие активной β-галактозидазы. Это также позволяет использовать бактериальную β-галактозидазу (так называемую lacZ) в качестве репортерного гена в различных приложениях. Аналогично, Xαgal используется в качестве репортерного соединения для α-галактозидазы (например, Mel1 в дрожжах).
X gal is an analog of lactose, and therefore may be hydrolyzed by the β galactosidase enzyme which cleaves the β glycosidic bond in lactose. X gal, when cleaved by β galactosidase, yields galactose and 5 bromo 4 chloro 3 hydroxyindole 1. The latter then spontaneously dimerizes and is oxidized into 5,5' dibromo 4,4' dichloro indigo 2, an intensely blue product which is insoluble. X gal itself is colorless, so the presence of blue colored product may therefore be used as a test for the presence of active β galactosidase. This also allows for bacterial β galactosidase (so called lacZ ) to be used as a reporter in various applications. Similarly, Xαgal is used as a reporter compound for α galactosidase (e. g. Mel1 in yeast).
Клонирование
При клонировании генов X-галь используется в качестве визуального индикатора экспрессии клеткой функционального β-галактозидазного фермента в технике, называемой синим/белым скринингом. Этот метод скрининга – удобный способ отличить успешный продукт клонирования от неудачных. Метод синего/белого скрининга основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы, когда фрагмент гена *lacZ* (*lacZα*) в плазмиде может комплементировать другой мутантный ген *lacZ* (*lacZΔM15*) в клетке. Каждый из этих генов по отдельности производит нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, при трансформации клеток *lacZΔM15* плазмидой, содержащей *lacZα*, образуется функциональная β-галактозидаза. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить при выращивании клеток на пластинах, содержащих X-галь, где синий продукт реакции осаждается внутри клеток, формируя характерные синие колонии. Однако множественный сайт клонирования, куда может быть лигация гена-кандидата в плазмидный вектор, расположен внутри гена *lacZα*. Успешная лигация, следовательно, нарушает ген *lacZα*, что приводит к прекращению α-комплементации и невозможности образования функциональной β-галактозидазы, в результате чего формируются белые колонии. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко идентифицировать по белому цвету, отличающему их от неудачных синих колоний. Примеры векторов клонирования, используемых для этого теста, включают pUC19, pBluescript, pGem T Vectors, а также требуется использование специфических штаммов *E. coli* хозяина, таких как DH5α, несущий мутантный ген *lacZΔM15*. Часто пластины, содержащие X-галь, также содержат IPTG (изопропил-β-1-тиогалактопиранозид). IPTG является химическим аналогом лактозы, но не гидролизуется β-галактозидазой. IPTG используется в качестве индуктора, который связывается с лак-репрессором, высвобождая ДНК и позволяя транскрипцию. Таким образом, присутствие IPTG в агарной среде увеличивает синтез β-галактозидазы.
In gene cloning, X gal is used as a visual indication of whether a cell expresses a functional β galactosidase enzyme in a technique called blue/white screening. This method of screening is a convenient way of distinguishing a successful cloning product from other unsuccessful ones. The blue/white screening method relies on the principle of α complementation of the β galactosidase gene, where a fragment of the lacZ gene (lacZα) in the plasmid can complement another mutant lacZ gene (lacZΔM15) in the cell. Both genes by themselves produce non functional peptides, however, when expressed together, as when a plasmid containing lacZα is transformed into a lacZΔM15 cells, they form a functional β galactosidase. The presence of an active β galactosidase may be detected when cells are grown in plates containing X gal, the blue colored product precipitated within cells resulted in the characteristic blue colonies. However, the multiple cloning site, where a gene of interest may be ligated into the plasmid vector, is located within the lacZα gene. Successful ligation therefore disrupts the lacZα gene, α complementation is therefore also disrupted and no functional β galactosidase can form, resulting in white colonies. Cells containing successfully ligated insert can then be easily identified by its white coloration from the unsuccessful blue ones. Example of cloning vectors used for this test are pUC19, pBluescript, pGem T Vectors, and it also requires the use of specific E. coli host strains such as DH5α which carries the mutant lacZΔM15 gene. Often, the plate containing X Gal also contains IPTG (isopropyl β 1 thiogalactopyranoside). IPTG is a chemical structure analogue of lactose. However, IPTG cannot be hydrolyzed by β galactosidase. IPTG is used as an inducer that binds to lac repressor releasing the DNA and allowing transcription. The presence of IPTG in the agar plate therefore increases the synthesis of β galactosidase.
Взаимодействие белков
В двухгибридном анализе β-галактозидаза может использоваться в качестве репортерного гена для выявления взаимодействующих белков. В этом методе геномные библиотеки могут быть проанализированы на предмет белок-белковых взаимодействий с использованием дрожжевой или бактериальной системы. Успешное взаимодействие между исследуемыми белками приводит к связыванию домена активации с промотором. Если промотор связан с геном lacZ, то продукция β-галактозидазы, вызывающая образование колоний с синей пигментацией в присутствии X-gal, указывает на успешное взаимодействие белков. Эффективность этого метода может быть ограничена при скрининге библиотек размером более 10⁶. Успешное расщепление X-gal также сопровождается образованием заметного неприятного запаха из-за испарения индола.
In two hybrid analysis, β galactosidase may be used as a reporter to identify proteins that interact with each other. In this method, genome libraries may be screened for protein interaction using yeast or bacterial system. Where there is a successful interaction between proteins being screened, it will result to the binding of an activation domain to a promoter. If the promoter is linked to a lacZ gene, the production of β galactosidase, which results in the formation of blue pigmented colonies in the presence of X gal, will therefore indicate a successful interaction between proteins. This technique may be limited to screening libraries of size of less than around 106. The successful cleavage of X gal also creates a noticeably foul odor due to the volatilization of indole.