Северный блоттинг: метод исследования экспрессии генов.
Northern blot
Нортерн-блоттинг: анализ экспрессии генов в молекулярной биологии. Обнаружение РНК, электрофорез, гибридизация – для изучения клеточных процессов и заболеваний.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Техника молекулярной биологии
Molecular biology technique
Северный блот, или РНК-блот, – это метод, используемый в исследованиях молекулярной биологии для изучения экспрессии генов путем обнаружения РНК (или изолированной мРНК) в образце. С помощью северного блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией, определяя скорость экспрессии конкретных генов в процессе дифференциации и морфогенеза, а также при аномальных или патологических состояниях. Северный блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и их последующее обнаружение с помощью гибридизационного зонда, комплементарного части или всей целевой последовательности. В строгом смысле, термин «северный блот» относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют северным блоттингом. Техника северного блоттинга была разработана в 1977 году Джеймсом Алвайном, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком в Стэнфордском университете. Название «северный блот» происходит от его сходства с первой техникой блоттинга – южным блоттом, названным в честь биолога Эдвина Саузерна. Основное различие заключается в том, что в северном блоттинге анализируется РНК, а не ДНК.
The northern blot, or RNA blot, is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA (or isolated mRNA) in a sample. With northern blotting it is possible to observe cellular control over structure and function by determining the particular gene expression rates during differentiation and morphogenesis, as well as in abnormal or diseased conditions. Northern blotting involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size, and detection with a hybridization probe complementary to part of or the entire target sequence. Strictly speaking, the term 'northern blot' refers specifically to the capillary transfer of RNA from the electrophoresis gel to the blotting membrane. However, the entire process is commonly referred to as northern blotting. The northern blot technique was developed in 1977 by James Alwine, David Kemp, and George Stark at Stanford University. Northern blotting takes its name from its similarity to the first blotting technique, the Southern blot, named for biologist Edwin Southern. The major difference is that RNA, rather than DNA, is analyzed in the northern blot.
Процедура
Затем образцы РНК разделяют с помощью гелевого электрофореза. Поскольку гели хрупкие и зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, разделенные по размеру, переносят на нейлоновую мембрану с помощью капиллярного или вакуумного блоттинга. Нейлоновая мембрана с положительным зарядом наиболее эффективна для северного блоттинга, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают к ней высоким сродством. Буфер для переноса, используемый при блоттинге, обычно содержит формамид, так как он снижает температуру отжига при взаимодействии зонда с РНК, устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. После переноса РНК на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-излучения или нагревания. После мечения зонд гибридизуется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, влияющие на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, количество неспаренных оснований и состав оснований. Мембрану промывают для обеспечения специфического связывания зонда и предотвращения появления фоновых сигналов. Гибридные сигналы затем детектируются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно оценены с помощью денситометрии. В качестве контрольных образцов для сравнения в северном блотте можно использовать образцы, не содержащие интересующего генного продукта, предварительно идентифицированные с помощью микромассивов или RT-ПЦР. Гели можно окрасить бромидом этидия (EtBr) и просмотреть под УФ-светом для оценки качества и количества РНК перед блоттингом. Для определения размера фрагментов часто используют РНК-лесенку вместе с образцами на геле электрофореза, но в общих образцах РНК рибосомные субъединицы могут служить маркерами размера.
A general blotting procedure RNA samples are then separated by gel electrophoresis. Since the gels are fragile and the probes are unable to enter the matrix, the RNA samples, now separated by size, are transferred to a nylon membrane through a capillary or vacuum blotting system. A nylon membrane with a positive charge is the most effective for use in northern blotting since the negatively charged nucleic acids have a high affinity for them. The transfer buffer used for the blotting usually contains formamide because it lowers the annealing temperature of the probe RNA interaction, thus eliminating the need for high temperatures, which could cause RNA degradation. Once the RNA has been transferred to the membrane, it is immobilized through covalent linkage to the membrane by UV light or heat. After a probe has been labeled, it is hybridized to the RNA on the membrane. Experimental conditions that can affect the efficiency and specificity of hybridization include ionic strength, viscosity, duplex length, mismatched base pairs, and base composition. The membrane is washed to ensure that the probe has bound specifically and to prevent background signals from arising. The hybrid signals are then detected by X ray film and can be quantified by densitometry. To create controls for comparison in a northern blot, samples not displaying the gene product of interest can be used after determination by microarrays or RT PCR. The gels can be stained with ethidium bromide (EtBr) and viewed under UV light to observe the quality and quantity of RNA before blotting. An RNA ladder is often run alongside the samples on an electrophoresis gel to observe the size of fragments obtained but in total RNA samples the ribosomal subunits can act as size markers.
Зонды
Пробы для северного блоттинга состоят из нуклеиновых кислот, комплементарных по последовательности всей или части РНК, представляющей интерес. Они могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотидами, содержащими не менее 25 комплементарных оснований к целевой последовательности. Пробы должны быть мечены либо радиоактивными изотопами (32P), либо с помощью химиолюминесценции, в которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP) расщепляют химиолюминесцентные субстраты, генерируя обнаружимое свечение. Химиолюминесцентная метка может быть нанесена двумя способами: либо зонд напрямую конъюгирован с ферментом, либо зонд мечен лигандом (например, биотином), к которому, в свою очередь, присоединен фермент (например, HRP) через другой лиганд (например, авидин или стрептавидин). Эта методика использовалась для демонстрации переэкспрессии онкогенов и подавления экспрессии генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с "нормальной" тканью. Если на северном блоттинге наблюдается повышенное количество мРНК, свидетельствующее об увеличении экспрессии гена, образец может быть секвенирован для определения, известен ли этот ген исследователям или представляет собой новое открытие. Преимущество микрочипов перед северным блоттингом заключается в возможности одновременного анализа тысяч генов, в то время как северный блоттинг обычно используется для изучения одного или небольшого числа генов.
Probes for northern blotting are composed of nucleic acids with a complementary sequence to all or part of the RNA of interest. They can be DNA, RNA, or oligonucleotides with a minimum of 25 complementary bases to the target sequence. The probes must be labelled either with radioactive isotopes (32P) or with chemiluminescence in which alkaline phosphatase or horseradish peroxidase (HRP) break down chemiluminescent substrates producing a detectable emission of light. The chemiluminescent labelling can occur in two ways: either the probe is attached to the enzyme, or the probe is labelled with a ligand (e. g. biotin) for which the ligand (e. g., avidin or streptavidin) is attached to the enzyme (e. g. HRP). The technique has been used to show overexpression of oncogenes and downregulation of tumor suppressor genes in cancerous cells when compared to 'normal' tissue, If an upregulated gene is observed by an abundance of mRNA on the northern blot the sample can then be sequenced to determine if the gene is known to researchers or if it is a novel finding. The advantage that microarrays have over northern blots is that thousands of genes can be visualized at a time, while northern blotting is usually looking at one or a small number of genes.
Обратный северный блот
Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный северный блот. В этой процедуре субстратом нуклеиновой кислоты (закреплённым на мембране) является коллекция изолированных фрагментов ДНК, а зондом служит РНК, выделенная из ткани и радиоактивно меченая. Использование ДНК-микрочипов, получивших широкое распространение в конце 1990-х – начале 2000-х годов, больше напоминает обратную процедуру, поскольку в них также используются изолированные фрагменты ДНК, закреплённые на подложке, и гибридизация с зондом, созданным из клеточной РНК. Таким образом, обратная процедура, хотя изначально и была редко используемой, позволила северному анализу эволюционировать в профилирование экспрессии генов, при котором можно отслеживать экспрессию многих (возможно, всех) генов организма.
Researchers occasionally use a variant of the procedure known as the reverse northern blot. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored.