ДНҚ микроматрицалары: құрамы, қолданылуы және принциптері

Кіріспе

ДНҚ микромассиві (ДНҚ чипі немесе биочип деп те аталады) – қатты бетке бекітілген микроскоптық ДНҚ нүктелерінің жиынтығы. Ғалымдар ДНҚ микромассивтерін бір мезгілде көптеген гендердің экспрессия деңгейін өлшеу үшін немесе геномның бірнеше аймақтарын генотиптеу үшін пайдаланады. Әрбір ДНҚ нүктесінде пикомольдер (10−12 моль) мөлшерінде белгілі бір ДНҚ тізбегі болады, олар зондтар (немесе репортерлер немесе олигомерлер) деп аталады. Бұл геннің немесе басқа ДНҚ элементінің қысқа бөлігі болуы мүмкін, ол cDNA немесе cRNA (антисенс РНК деп те аталады) үлгісін (мақсат деп аталады) жоғары қатаңдық жағдайында гибридтеу үшін қолданылады. Зонд пен мақсаттың гибридтеуі әдетте флуорофор, күміс немесе химилюминесценциямен белгіленген мақсаттарды анықтау және сандық бағалау арқылы жүзеге асырылады, бұл мақсаттағы нуклеин қышқылы тізбектерінің салыстырмалы мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді. Алғашқы нуклеин қышқылы массивтері шамамен 9 см × 12 см көлемдес макромассивтер болды және алғашқы компьютерлік суреттерге негізделген талдау 1981 жылы жарияланды. Оны Патрик О. Браун ойлап тапты. Оның қолданылуының мысалы – жүрек-қан тамырлары ауруларындағы полиморфизмдер, қатерлі ісіктер, патогендер және GWAS талдаулары үшін SNPs массивтері. Сонымен қатар, ол құрылымдық өзгерістерді анықтау және ген экспрессиясын өлшеу үшін де қолданылады.

Принцип

Микроаррелердің негізгі принципі – екі ДНК тізбегі арасындағы гибридтеу, яғни, толықтыратын нуклеин қышқылының бір-бірімен нақты жұптасу қабілеті, толықтыратын нуклеотидтік негіз жұптары арасында сутекті байланыстар арқылы жүзеге асуы. Нуклеотидтік тізбектегі толықтыратын негіз жұптарының саны көп болған сайын, екі тізбек арасындағы ковалентті емес байланыс та күшті болады. Нақты емес байланыс тізбектерін жуып тастағаннан кейін, тек берік жұптасқан тізбектер ғана гибридтеуде қалады. Зонд тізбегіне байланысқан флуоресцентті белгіленген мақсатты тізбектер, гибридтеу жағдайларына (мысалы, температураға) және гибридтеуден кейінгі жууға байланысты сигнал тудырады. Дақтан (элементтен) келетін сигналдың жалпы күші, сол дақтағы зондтарға байланысқан мақсатты үлгінің мөлшеріне байланысты. Микроаррелер салыстырмалы сандық талдауды қолданады, онда элементтің қарқындылығы басқа жағдайдағы сол элементтің қарқындылығымен салыстырылады, ал элементтің идентификациясы оның орны бойынша анықталады.

Өндiру

Микроаррелерді зерттелетін зондтардың санына, құнына, жекешелендіру қажеттіліктеріне және қойылған ғылыми сұрақтардың типіне қарай әртүрлі жолдармен жасауға болады. Коммерциялық өндірушілерден алынған массивтерде 10 ғана немесе 5 миллионнан астам, тіпті одан да көп микрометрлік өлшемдегі зондтар болуы мүмкін.

Табылған массивтер мен ин-ситу синтезделген массивтер

Микромассивтерді әртүрлі технологияларды қолдана отырып жасауға болады, оның ішінде шыны слайдтарға жіңішке ұштармен басып шығару, алдын ала жасалған маскаларды пайдалана отырып фотолитография, динамикалық микрозеркалды құрылғыларды пайдалана отырып фотолитография, қаламқаппен басып шығару немесе микроэлектродтар массивтерінде электрохимия. Дақтандырылған микромассивтерде зондтар олигонуклеотидтер, кДНҚ немесе мРНҚ-ға сәйкес келетін ПТР өнімдерінің кішкентай фрагменттері болып табылады. Зондтар массивтің бетіне орналасудан бұрын синтезделеді, содан кейін шыныға "жабыстырылады". Көп қолданылатын тәсіл – ДНК зондтары бар еңбектерге батырылатын және содан кейін әрбір зондты массивтің бетіндегі белгіленген орындарға салатын роботты қолмен басқарылатын жіңішке қалқалар немесе инелер массивін пайдалану. Нәтижесінде алынған "тор" зондтардың нуклеин қышқылының профильдерін көрсетеді және тәжірибелік немесе клиникалық үлгілерден алынған толықтырылған кДНҚ немесе кРНҚ "мақсаттарын" қабылдауға дайын. Бұл әдісті әлемдегі ғылыми зерттеушілер өз зертханаларында "қарапайым" микромассивтерді жасау үшін пайдаланады. Бұл массивтерді әр тәжірибеге оңай бейімдеуге болады, себебі зерттеушілер зондтарды және массивтердегі басып шығару орындарын таңдай алады, зондтарды өз зертханаларында (немесе серіктес мекемеде) синтездей алады және массивтерді жабдықтай алады. Олар гибридтеу үшін өздерінің белгіленген үлгілерін жасайды, үлгілерді массивке гибридтейді және соңында массивтерді өз жабдықтарымен сканерлейді. Бұл әр зерттеу үшін жекешелендірілген салыстырмалы түрде төмен құнмен жасалған микромассивтерді қамтамасыз етеді және зерттеушіге қызығушылық тудырмайтын көптеген гендерді қамтитын, көбінесе қымбат тұратын коммерциялық массивтерді сатып алу қажеттілігін жояды. Жарияланған зерттеулерде көрсетілгендей, өздігінен жасалған микромассивтер коммерциялық олигонуклеотидтік массивтерге қарағанда сезімталдығы төмен болуы мүмкін, бұл шағын партиялардың мөлшерімен және олиго массивтерінің өнеркәсіптік өндірісімен салыстырғанда басып шығару тиімділігінің төмендеуіне байланысты болуы мүмкін. Олигонуклеотидтік микромассивтерде зондтар белгілі немесе болжамды ашық оқу кадрларының тізбектерінің бөліктеріне сәйкес келетін қысқа тізбектер болып табылады. Олигонуклеотидтік зондтар көбінесе "дақтандырылған" микромассивтерде қолданылса да, "олигонуклеотидтік массив" термині көбінесе өндірістің нақты әдісін білдіреді. Олигонуклеотидтік массивтер бір генді немесе гендік дәнекерлеу түрлерінің отбасын бейнелейтін қысқа олигонуклеотидтік тізбектерді басып шығару арқылы жасалады, бұл тізбекті массивтің бетіне тікелей синтездеу арқылы, толық тізбектерді салудың орнына жасалады. Тізбектер қажетті мақсатқа байланысты ұзын (60 мерлік зондтар, мысалы, Agilent дизайны) немесе қысқа (25 мерлік зондтар, Affymetrix жасаған) болуы мүмкін; ұзын зондтар жеке мақсатты гендерге көбірек сәйкес келеді, ал қысқа зондтарды массив бойынша жоғары тығыздықпен орналастыруға болады және оларды өндіру арзан. Олигонуклеотидтік массивлерді өндіру үшін қолданылатын әдістердің бірі – кремнийлі субстраттағы фотолитографиялық синтез (Affymetrix), онда жарық және жарыққа сезімтал маскалау агенттері массивтің бойында бір мезгілде бір нуклеотидтен тізбекті "құру" үшін қолданылады. Әрбір қолданылатын зонд таңдамалы түрде "ашылады", содан кейін массивті бір нуклеотидтің ерітіндісімен жуудан бұрын маскалау реакциясы жүзеге асырылады және келесі зондтар жиынтығы басқа нуклеотидтің әсеріне дайындық ретінде ашылады. Көптеген қайталаулардан кейін әрбір зондтың тізбегі толық құрылады. Соңғы уақытта NimbleGen Systems компаниясының Maskless Array Synthesis жүйесі икемділікті үлкен сандағы зондтармен үйлестірді.

Microarrays can be fabricated using a variety of technologies, including printing with fine pointed pins onto glass slides, photolithography using pre made masks, photolithography using dynamic micromirror devices, ink jet printing, or electrochemistry on microelectrode arrays. In spotted microarrays, the probes are oligonucleotides, cDNA or small fragments of PCR products that correspond to mRNAs. The probes are synthesized prior to deposition on the array surface and are then "spotted" onto glass. A common approach utilizes an array of fine pins or needles controlled by a robotic arm that is dipped into wells containing DNA probes and then depositing each probe at designated locations on the array surface. The resulting "grid" of probes represents the nucleic acid profiles of the prepared probes and is ready to receive complementary cDNA or cRNA "targets" derived from experimental or clinical samples. This technique is used by research scientists around the world to produce "in house" printed microarrays in their own labs. These arrays may be easily customized for each experiment, because researchers can choose the probes and printing locations on the arrays, synthesize the probes in their own lab (or collaborating facility), and spot the arrays. They can then generate their own labeled samples for hybridization, hybridize the samples to the array, and finally scan the arrays with their own equipment. This provides a relatively low cost microarray that may be customized for each study, and avoids the costs of purchasing often more expensive commercial arrays that may represent vast numbers of genes that are not of interest to the investigator. Publications exist which indicate in house spotted microarrays may not provide the same level of sensitivity compared to commercial oligonucleotide arrays, possibly owing to the small batch sizes and reduced printing efficiencies when compared to industrial manufactures of oligo arrays. In oligonucleotide microarrays, the probes are short sequences designed to match parts of the sequence of known or predicted open reading frames. Although oligonucleotide probes are often used in "spotted" microarrays, the term "oligonucleotide array" most often refers to a specific technique of manufacturing. Oligonucleotide arrays are produced by printing short oligonucleotide sequences designed to represent a single gene or family of gene splice variants by synthesizing this sequence directly onto the array surface instead of depositing intact sequences. Sequences may be longer (60 mer probes such as the Agilent design) or shorter (25 mer probes produced by Affymetrix) depending on the desired purpose; longer probes are more specific to individual target genes, shorter probes may be spotted in higher density across the array and are cheaper to manufacture. One technique used to produce oligonucleotide arrays include photolithographic synthesis (Affymetrix) on a silica substrate where light and light sensitive masking agents are used to "build" a sequence one nucleotide at a time across the entire array. Each applicable probe is selectively "unmasked" prior to bathing the array in a solution of a single nucleotide, then a masking reaction takes place and the next set of probes are unmasked in preparation for a different nucleotide exposure. After many repetitions, the sequences of every probe become fully constructed. More recently, Maskless Array Synthesis from NimbleGen Systems has combined flexibility with large numbers of probes.

Үлгілі протокол

Бұл ДНК микроарреэлік экспериментінің мысалы, онда ДНК микроарреэлік эксперименттерді жақсы түсіндіру үшін нақты бір жағдайға қатысты мәліметтер келтірілген, сондай-ақ РНК немесе басқа баламалы эксперименттерге енгізілетін өзгерістер тізімі берілген. Салыстырылатын екі сынама (жұптық салыстыру) өсіріледі немесе алынады. Бұл мысалда өңделген сынама (жағдай) және өңделмеген сынама (бақылау). Қызығушылық тудыратын нуклеин қышқылы тазартылады: бұл экспрессиялық профильдеу үшін РНК, салыстырмалы гибридтеу үшін ДНК немесе эпигенетикалық немесе реттеу зерттеулері үшін белгілі бір белокқа байланысқан ДНК/РНК болуы мүмкін (иммунопреципитация арқылы). Бұл мысалда жалпы РНК (ядролық және цитоплазмалық) гуанидиний тиоцианат фенол-хлороформ экстракциясы (мысалы, Trizol) арқылы бөлінеді, ол РНК-ның көп бөлігін бөліп алады (бағандық әдістерде 200 нуклеотидтен жоғарыларын бөле алмайды) және дұрыс орындалса, тазалығы жоғары болады. Тазартылған РНК сапасы (капиллярлық электрофорез арқылы) және саны (мысалы, NanoDrop немесе NanoPhotometer спектрометрі арқылы) талданады. Материалның сапасы қанағаттанарлық болса және жеткілікті саны болса (мысалы, >1 мкг, бірақ қажетті мөлшері микроаррей платформасына байланысты өзгереді), эксперимент жалғастырылуы мүмкін. Белгіленген өнім кері транскрипция арқылы жасалады, содан кейін қалау бойынша ПТР-амплификация жасалады. РНК поли(Т) праймерлерімен (тек мРНК-ны күшейтеді) немесе кездейсоқ праймерлермен (барлық РНК-ны күшейтеді, олардың көп бөлігі рРНК) кері транскрипцияланады. miRNA микроаррейлері тазартылған шағын РНК-ға (фракционермен бөлінген) олигонуклеотидті қосады, содан кейін ол кері транскрипцияланады және күшейтіледі. Белгілеу кері транскрипция кезеңінде немесе күшейтілген жағдайда күшейтуден кейін қосылады. Сезімдік белгілеу микроаррейге байланысты; мысалы, егер белгі RT қоспасымен қосылса, cDNA антисезімді, ал микроаррей зонды сезімді болады, теріс бақылаулар жағдайында басқаша. Белгілеу әдетте флуоресцентті болады; тек бір машина радиоактивті белгілерді қолданады. Белгілеу тікелей (қолданылмайды) немесе жанама (қосылу кезеңін қажет етеді) болуы мүмкін. Екі каналды массивтер үшін қосылу кезеңі гибридтеуден бұрын, аминоаллил-уридин трифосфаты (аминоаллил-UTP немесе aaUTP) және NHS аминореактивті бояғыштар (мысалы, цианин бояғыштары) қолданылады; бір каналды массивтер үшін қосылу кезеңі гибридтеуден кейін, биотин және белгіленген стрептавидин қолданылады. Өзгертілген нуклеотидтер (әдетте 1 aaUTP: 4 TTP (тимидин трифосфаты) арақатынасында) ферменттік жолмен қалыпты нуклеотидтерге аз мөлшерде қосылады, әдетте бұл 1 негізге 60 негізден келеді. aaDNA кейін баған арқылы тазартылады (фосфат буферлік ерітіндісі арқылы, өйткені Трис амин тобын қамтиды). Аминоаллил тобы - реактивті бояумен әрекеттесетін нуклеобазаға қосылған ұзын байланыс тізбегіндегі амин тобы. Екі каналды эксперименттерде бояу артефактілерін бақылау үшін бояу флипі деп аталатын репликацияның бір түрі орындалуы мүмкін; бояу флипі үшін екінші слайд қолданылады, белгілер ауыстырылады (бірінші слайдта Cy3-пен белгіленген сынама Cy5-пен белгіленеді және керісінше). Бұл мысалда, aminoallyl UTP кері транскрипцияланған қоспада бар. Содан кейін белгіленген сынамалар SDS, SSC, декстран сульфаты, блоктаушы агент (мысалы, Cot 1 ДНК, лосось спермасының ДНК, бұзау тимусының ДНК, PolyA немесе PolyT), Денхардт ерітіндісі немесе формаминнен тұратын құпия гибридтеу ерітіндісімен араластырылады. Қоспа денатурацияланып, микроаррейдің тесіктеріне қосылады. Тесіктер герметикалық жабылады және микроаррей гибридтеледі, гибб пешінде, онда микроаррей айналу арқылы араластырылады, немесе араластырғышта, онда микроаррей иін тесіктеріндегі ауыспалы қысыммен араластырылады. Бір түндік гибридтеуден кейін барлық ерекше емес байланыстар жуылады (SDS және SSC). Микроаррей кептіріліп, лазер арқылы бояуды қоздыратын және детектормен эмиссия деңгейін өлшейтін машинамен сканерленеді. Кескін үлгімен кестеленеді және әрбір элементтің (бірнеше пикселден тұратын) интенсивтілігі өлшенеді. Шикі деректер нормаландырылады; ең қарапайым нормалау әдісі - фондық интенсивтілікті азайту және екі каналдың элементтерінің жалпы интенсивтіліктері тең болуы үшін масштабтау немесе барлық интенсивтіліктердің t мәнін есептеу үшін эталондық геннің интенсивтілігін пайдалану. З-қатынас, лосс және лоуэсс регрессиясы және Affymetrix чиптері үшін (бір каналды, кремнийлі чип, ин-ситу синтезделген қысқа олигонуклеотидтер) RMA (robust multichip analysis) сияқты күрделі әдістер де бар.

This is an example of a DNA microarray experiment which includes details for a particular case to better explain DNA microarray experiments, while listing modifications for RNA or other alternative experiments. The two samples to be compared (pairwise comparison) are grown/acquired. In this example treated sample (case) and untreated sample (control). The nucleic acid of interest is purified: this can be RNA for expression profiling, DNA for comparative hybridization, or DNA/RNA bound to a particular protein which is immunoprecipitated (ChIP on chip) for epigenetic or regulation studies. In this example total RNA is isolated (both nuclear and cytoplasmic) by Guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction (e. g. Trizol) which isolates most RNA (whereas column methods have a cut off of 200 nucleotides) and if done correctly has a better purity. The purified RNA is analysed for quality (by capillary electrophoresis) and quantity (for example, by using a NanoDrop or NanoPhotometer spectrometer). If the material is of acceptable quality and sufficient quantity is present (e. g., >1μg, although the required amount varies by microarray platform), the experiment can proceed. The labeled product is generated via reverse transcription and followed by an optional PCR amplification. The RNA is reverse transcribed with either polyT primers (which amplify only mRNA) or random primers (which amplify all RNA, most of which is rRNA). miRNA microarrays ligate an oligonucleotide to the purified small RNA (isolated with a fractionator), which is then reverse transcribed and amplified. The label is added either during the reverse transcription step, or following amplification if it is performed. The sense labeling is dependent on the microarray; e. g. if the label is added with the RT mix, the cDNA is antisense and the microarray probe is sense, except in the case of negative controls. The label is typically fluorescent; only one machine uses radiolabels. The labeling can be direct (not used) or indirect (requires a coupling stage). For two channel arrays, the coupling stage occurs before hybridization, using aminoallyl uridine triphosphate (aminoallyl UTP, or aaUTP) and NHS amino reactive dyes (such as cyanine dyes); for single channel arrays, the coupling stage occurs after hybridization, using biotin and labeled streptavidin. The modified nucleotides (usually in a ratio of 1 aaUTP: 4 TTP (thymidine triphosphate)) are added enzymatically in a low ratio to normal nucleotides, typically resulting in 1 every 60 bases. The aaDNA is then purified with a column (using a phosphate buffer solution, as Tris contains amine groups). The aminoallyl group is an amine group on a long linker attached to the nucleobase, which reacts with a reactive dye. A form of replicate known as a dye flip can be performed to control for dye artifacts in two channel experiments; for a dye flip, a second slide is used, with the labels swapped (the sample that was labeled with Cy3 in the first slide is labeled with Cy5, and vice versa). In this example, aminoallyl UTP is present in the reverse transcribed mixture. The labeled samples are then mixed with a proprietary hybridization solution which can consist of SDS, SSC, dextran sulfate, a blocking agent (such as Cot 1 DNA, salmon sperm DNA, calf thymus DNA, PolyA, or PolyT), Denhardt's solution, or formamine. The mixture is denatured and added to the pinholes of the microarray. The holes are sealed and the microarray hybridized, either in a hyb oven, where the microarray is mixed by rotation, or in a mixer, where the microarray is mixed by alternating pressure at the pinholes. After an overnight hybridization, all nonspecific binding is washed off (SDS and SSC). The microarray is dried and scanned by a machine that uses a laser to excite the dye and measures the emission levels with a detector. The image is gridded with a template and the intensities of each feature (composed of several pixels) is quantified. The raw data is normalized; the simplest normalization method is to subtract background intensity and scale so that the total intensities of the features of the two channels are equal, or to use the intensity of a reference gene to calculate the t value for all of the intensities. More sophisticated methods include z ratio, loess and lowess regression and RMA (robust multichip analysis) for Affymetrix chips (single channel, silicon chip, in situ synthesized short oligonucleotides).

Микромассивтер мен биоинформатика

Арзан микроаррейлік эксперименттердің пайда болуы бірнеше ерекше биоинформатикалық міндеттерді тудырды: эксперименттік жобалаудағы көп деңгейлі қайталау (Эксперименттік жобалау); платформалар мен тәуелсіз топтар саны және дерек форматтарының әртүрлілігі (Стандарттау); деректерді статистикалық өңдеу (Деректерді талдау); әр зондты ол өлшейтін мРНК транскриптісімен сәйкестендіру (Аннотация); деректердің өте көп көлемі және оларды бөлісу мүмкіндігі (Деректерді сақтау).

Эксперименттік жобалау

Гендік экспрессияның биологиялық күрделілігіне байланысты, экспрессиялық профильдеу мақаласында талқыланған эксперименттік жобалау мәселелері, деректерден статистикалық және биологиялық тұрғыдан дұрыс қорытындылар жасау үшін өте маңызды. Микроаррей экспериментін жобалау кезінде қарастырылатын үш негізгі элемент бар. Біріншіден, эксперименттен қорытынды жасау үшін биологиялық үлгілерді көбейту қажет. Екіншіден, техникалық көшірмелер (мысалы, әрбір эксперименттік бірліктен алынған екі РНК үлгісі) дәлдікті бағалауға көмектеседі. Биологиялық көшірмелер тәуелсіз РНК-ны бөліп алуды қамтиды. Техникалық көшірмелер бір бөліп алудың екі аликвоты болуы мүмкін. Үшіншіден, микроаррей слайдындағы әрбір кДҚ клонының немесе олигонуклеотидтің нүктелері көшірмелер (кемінде екі дана) түрінде ұсынылады, бұл әрбір гибридтеуде техникалық дәлдікті бағалауға мүмкіндік береді. Эксперименттегі тәуелсіз бірліктерді анықтау және статистикалық маңыздылықты артық бағалауды болдырмау үшін, үлгіні дайындау және өңдеу туралы ақпаратты талқылау өте маңызды.

Стандарттау

Микроаррей деректерін алмасу қиын, себебі платформа жасау, сынақ хаттамалары және талдау әдістерінде стандарттаудың жетіспеушілігі бар. Бұл биоинформатикада өзара үйлесімділік мәселесін тудырады. Әртүрлі бастапқы кодты ашық жобалар меншік емес чиптермен алынған деректерді алмасуды және талдауды жеңілдетуге тырысады: Мысалы, "Микроаррей эксперименті туралы ең аз ақпарат" (MIAME) тізімі қандай деңгейде толық ақпарат болуы керек екенін анықтауға көмектеседі және көптеген журналдар микроаррей нәтижелерін қамтитын мақалаларды қабылдау үшін талап ретінде пайдаланады. Бірақ MIAME ақпарат форматын сипаттамайды, сондықтан көптеген форматтар MIAME талаптарын қолдай алса да, lc=y уақытына дейін ешбір формат толық семантикалық сәйкестілікті тексеруге мүмкіндік бермейді. "Микроаррей сапаны бақылау (MAQC) жобасы" АҚШ-тың Азық-түлік және дәрі-дәрмек басқармасы (FDA) тарапынан стандарттар мен сапаны бақылау өлшемдерін әзірлеу үшін жүргізілуде, бұл ақырында дәрі-дәрмектерді табу, клиникалық тәжірибе және реттеуші шешімдерді қабылдау кезінде микроаррей деректерін пайдалануға мүмкіндік береді. MGED қоғамы гендік экспрессия эксперименттерінің нәтижелерін және тиісті түсіндірмелерді ұсыну стандарттарын әзірледі.

Деректерді талдау

Микроаррейлік деректер жиынтығы көбінесе өте үлкен болады, ал талдаудың дәлдігіне бірнеше фактор әсер етеді. Статистикалық қиындықтарға фондық шудың әсерін ескеру және деректерді тиісті нормалау кіреді. Нормалау әдістері нақты платформаларға бейімделуі мүмкін, ал коммерциялық платформалар үшін талдау құпиялы болуы мүмкін. Статистикалық талдауға әсер ететін алгоритмдер:

Кескін талдау: тор құру, сканерленген кескіндегі белгілерді анықтау (сегментациялау алгоритмі), нашар сапалы және төмен интенсивтілік белгілерді жою немесе белгілеу (маркировкалау). Деректерді өңдеу: фонды жою (жалпы немесе жергілікті фонға негізделген), белгілердің интенсивтігін және интенсивтілік қатынастарын анықтау, деректерді визуализациялау (мысалы, MA графигін қараңыз), қатынастарды логарифмдеу, интенсивтілік қатынастарын жалпы немесе жергілікті нормалау және қадамды анықтау алгоритмдерін қолдана отырып, көшірме санының әртүрлі аймақтарына сегментациялау. Сыныптарды анықтау талдауы: Бұл талдау тәсілі, кейде қадағалаусыз жіктеу немесе білімді ашу деп аталады, микроаррейлерді (объектілер, пациенттер, егеуқұйрықтар және т.б.) немесе гендерді топтастыруға тырысады. Бірге топтасқан табиғи топтарды (микроаррейлер немесе гендер) анықтау, бұрын белгілі болмаған жаңа топтарды табуға мүмкіндік береді. Білімді ашу талдауы кезінде ДНК микроаррейлік деректерімен массивтердің жаңа кластерлерін (сыныптарын) анықтау үшін әртүрлі қадағалаусыз жіктеу әдістерін қолдануға болады. Бұл тәсіл гипотезаға негізделмейді, керісінше, деректердегі кластерлердің "оптималды" санын табу үшін итеративті үлгілерді тану немесе статистикалық оқыту әдістеріне негізделген. Қадағалаусыз талдау әдістерінің мысалдары: өзін-өзі ұйымдастыру карталары, нейрондық газ, k-орталықтар кластерлік талдауы, иерархиялық кластерлік талдау, геномдық сигналды өңдеуге негізделген кластерлеу және модельге негізделген кластерлік талдау. Кейбір әдістерде пайдаланушы екі объект арасындағы қашықтық өлшемін анықтауы керек. Пирсонның корреляциялық коэффициенті көбінесе қолданылса да, әдебиетте бірнеше басқа өлшемдер ұсынылған және бағаланған. Сыныптарды анықтау талдауында қолданылатын кіріс деректері көбінесе вариация коэффициентінің төмен мәндері немесе Шеннон энтропиясының жоғары мәндері сияқты, жоғары ақпараттық мазмұны бар (төмен шулы) гендердің тізімдеріне негізделген. Қадағалаусыз талдаудан алынған кластерлердің ең мүмкін немесе оңтайлы санының анықталуы кластерлік жарамдылық деп аталады. Кластерлік жарамдылық үшін жиі қолданылатын метрикалар: силуэт индексі, Дэвис-Боулдин индексі, Данн индексі немесе Губерт статистикасы. Сыныпты болжау талдауы: Бақыланатын жіктеу деп аталатын бұл тәсіл, болашақтағы белгісіз сынақ объектілерін сынақ объектілерінің ең мүмкін сыныптық жататындығын болжау үшін енгізуге болатын болжау моделін құруға негізделген. Бақыланатын талдау микроаррейлік деректер жиынтығына бейімделген Mann-Whitney сынақтарының әдістерін, көптеген салыстыруларды немесе кластерлік талдауды ескереді. Бұл әдістер деректердегі вариацияға және эксперименттік репликаттардың санына негізделген статистикалық қуатты бағалайды және талдаудағы I және II типтегі қателерді азайтуға көмектеседі. Өлшемді азайту: Талдаушылар көбінесе деректерді талдау алдында өлшемдердің (гендердің) санын азайтады. Салмақты генологиялық коэкспрессия желісінің талдауы коэкспрессия модульдерін және интрамодулярлық хаб гендерін анықтау үшін кеңінен қолданылады. Модульдер жасуша түрлеріне немесе жолдарға сәйкес келуі мүмкін. Жоғары байланысты интрамодулярлық хабтар өздерінің модульдерін жақсы көрсетеді. Микроаррейлік деректерді түсінуді және нақты талдауды жеңілдету үшін деректердің өлшемділігін азайтуға бағытталған қосымша өңдеуді қажет етуі мүмкін. Басқа әдістер биологиялық немесе техникалық репликаттардың аз санынан тұратын деректерді талдауға мүмкіндік береді; мысалы, жергілікті жиналған қате (LPE) тесті жеткіліксіз репликацияны өтеу үшін ұқсас экспрессия деңгейлері бар гендердің стандартты ауытқуларын жинақтайды.

Image analysis: gridding, spot recognition of the scanned image (segmentation algorithm), removal or marking of poor quality and low intensity features (called flagging). Data processing: background subtraction (based on global or local background), determination of spot intensities and intensity ratios, visualisation of data (e. g. see MA plot), and log transformation of ratios, global or local normalization of intensity ratios, and segmentation into different copy number regions using step detection algorithms. Class discovery analysis: This analytic approach, sometimes called unsupervised classification or knowledge discovery, tries to identify whether microarrays (objects, patients, mice, etc.) or genes cluster together in groups. Identifying naturally existing groups of objects (microarrays or genes) which cluster together can enable the discovery of new groups that otherwise were not previously known to exist. During knowledge discovery analysis, various unsupervised classification techniques can be employed with DNA microarray data to identify novel clusters (classes) of arrays. This type of approach is not hypothesis driven, but rather is based on iterative pattern recognition or statistical learning methods to find an "optimal" number of clusters in the data. Examples of unsupervised analyses methods include self organizing maps, neural gas, k means cluster analyses, hierarchical cluster analysis, Genomic Signal Processing based clustering and model based cluster analysis. For some of these methods the user also has to define a distance measure between pairs of objects. Although the Pearson correlation coefficient is usually employed, several other measures have been proposed and evaluated in the literature. The input data used in class discovery analyses are commonly based on lists of genes having high informativeness (low noise) based on low values of the coefficient of variation or high values of Shannon entropy, etc. The determination of the most likely or optimal number of clusters obtained from an unsupervised analysis is called cluster validity. Some commonly used metrics for cluster validity are the silhouette index, Davies Bouldin index, Dunn's index, or Hubert's statistic. Class prediction analysis: This approach, called supervised classification, establishes the basis for developing a predictive model into which future unknown test objects can be input in order to predict the most likely class membership of the test objects. Supervised analysisMann–Whitney test methods tailored to microarray data sets, which take into account multiple comparisons or cluster analysis. These methods assess statistical power based on the variation present in the data and the number of experimental replicates, and can help minimize Type I and type II errors in the analyses. Dimensional reduction: Analysts often reduce the number of dimensions (genes) prior to data analysis. Weighted gene co expression network analysis is widely used for identifying co expression modules and intramodular hub genes. Modules may corresponds to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs best represent their respective modules. Microarray data may require further processing aimed at reducing the dimensionality of the data to aid comprehension and more focused analysis. Other methods permit analysis of data consisting of a low number of biological or technical replicates; for example, the Local Pooled Error (LPE) test pools standard deviations of genes with similar expression levels in an effort to compensate for insufficient replication.

Жазбаша түсініктеме

Зонд пен оның анықтауы тиіс мРНК арасындағы қатынас оңай емес. Кейбір мРНК-лар массивтегі басқа мРНК-ны анықтауға арналған зондтармен жалтастырып жіберуі мүмкін. Сонымен қатар, мРНК-лар тізбекке немесе молекулаға қатысты күшейтуге бейімділік танытуы мүмкін. Үшіншіден, нақты бір геннің мРНК-сын анықтауға арналған зондтар сол генмен дұрыс емес байланыстырылған геномдық ЭСТ ақпаратына сүйенуі мүмкін.

Деректер қоймасы

Микроаррельдік деректер басқа ұқсас деректер жиынтықтарымен салыстырғанда тиімдірек деп табылған. Деректердің көп көлемі, ерекше форматтары (мысалы, MIAME) және осы деректер жиынтықтарымен байланысты жинақтау жұмыстары деректерді сақтау үшін арнайы деректер базасын қажет етеді. InterMine және BioMart сияқты бірнеше ашық кодты деректер қоймасы шешімдері әртүрлі биологиялық деректерді біріктіру және талдауды қолдау мақсатымен жасалған.

Баламалы технологиялар

Массивті параллельді секвенделеудегі жетістіктер РНК-Seq технологиясының дамуына әкелді, бұл гендік экспрессияны сипаттау және мөлшерлеу үшін толық транскриптомды тікелей талдауға мүмкіндік береді. Микрочиптерден айырмашылығы, микрочиптің өзі жобаланбас бұрын анықтамалық геном мен транскриптом болуы керек, РНК-Seq геномдары әлі секвенделенбеген жаңа модельді организмдер үшін де қолданылуы мүмкін.