ДНК-микрочипы: принципы и применение.

Введение

Коллекция микроскопических пятен ДНК, прикрепленных к твердой поверхности.

Микромассив ДНК (также широко известный как ДНК-чип или биочип) представляет собой коллекцию микроскопических пятен ДНК, прикрепленных к твердой поверхности. Ученые используют микромассивы ДНК для одновременного измерения уровней экспрессии большого числа генов или для генотипирования множественных участков генома. Каждое пятно ДНК содержит пикомоли (10−12 молей) специфической последовательности ДНК, известной как зонды (или репортеры, или олигонуклеотиды). Это могут быть короткие фрагменты гена или другого элемента ДНК, используемые для гибридизации образца кДНК или кРНК (также называемой антисмысловой РНК) – называемой мишенью – в условиях высокой строгости. Гибридизация зонда и мишени обычно обнаруживается и количественно оценивается путем детекции флуорофорами, серебром или хемилюминесцентными метками мишени для определения относительного количества нуклеиновых кислотных последовательностей в мишени. Изначальные массивы нуклеиновых кислот представляли собой макромассивы размером приблизительно 9 см × 12 см, а первая компьютерная система анализа изображений была опубликована в 1981 году. Изобретателем является Патрик О. Браун. Примером применения является использование SNP-массивов для анализа полиморфизмов при сердечно-сосудистых заболеваниях, раке, инфекциях и GWAS-анализе. Также он используется для идентификации структурных вариаций и измерения экспрессии генов.

Принцип

Основным принципом микромассивов является гибридизация между двумя цепями ДНК, свойство комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот специфически соединяться друг с другом посредством образования водородных связей между комплементарными парами нуклеотидных оснований. Большое количество комплементарных пар оснований в нуклеотидной последовательности означает более прочную нековалентную связь между двумя цепями. После удаления неспецифически связавшихся последовательностей, гибридизованными останутся только прочно спаренные цепи. Флуоресцентно меченые целевые последовательности, связывающиеся с последовательностью зондов, генерируют сигнал, зависящий от условий гибридизации (например, температуры) и промывки после гибридизации. Общая сила сигнала от пятна (элемента) зависит от количества целевого образца, связывающегося с зондами, присутствующими в этом пятне. Микромассивы используют относительную количественную оценку, при которой интенсивность элемента сравнивается с интенсивностью того же элемента в других условиях, а идентичность элемента определяется по его положению.

Изготовление

Микромассивы могут быть изготовлены различными способами, в зависимости от количества исследуемых зондов, стоимости, требований к индивидуализации и типа решаемого научного вопроса. Массивы от коммерческих поставщиков могут содержать от 10 зондов до 5 миллионов и более зондов микрометрового размера.

Установленные и синтезированные на месте массивы

Микромассивы могут быть изготовлены с использованием различных технологий, включая печать тонкими заостренными штифтами на стеклянных слайдах, фотолитографию с использованием готовых масок, фотолитографию с использованием динамических микрозеркальных устройств, струйную печать или электрохимию на микроэлектродных массивах. В микромассивах, полученных методом нанесения пятен, зонды представляют собой олигонуклеотиды, кДНК или небольшие фрагменты продуктов ПЦР, соответствующие мРНК. Зонды синтезируются перед нанесением на поверхность массива, а затем "наносятся пятнами" на стекло. Распространенный подход использует массив тонких штифтов или игл, управляемых роботизированной рукой, которые погружаются в лунки, содержащие ДНК-зонды, и затем доставляют каждый зонд в определенные места на поверхности массива. Полученная "сетка" зондов представляет собой профили нуклеиновых кислот подготовленных зондов и готова к приему комплементарных "мишеней" кДНК или сРНК, полученных из экспериментальных или клинических образцов. Этот метод используется исследователями по всему миру для производства "собственных" печатных микромассивов в своих лабораториях. Эти массивы могут быть легко настроены для каждого эксперимента, поскольку исследователи могут выбирать зонды и места нанесения пятен на массивах, синтезировать зонды в своей лаборатории (или в сотрудничающей организации) и наносить пятна на массивы. Затем они могут генерировать собственные меченые образцы для гибридизации, гибридизировать образцы с массивом и, наконец, сканировать массивы с помощью собственного оборудования. Это обеспечивает относительно недорогой микромассив, который можно настроить для каждого исследования, и позволяет избежать затрат на покупку часто более дорогих коммерческих массивов, которые могут представлять огромное количество генов, не представляющих интереса для исследователя. Имеются публикации, указывающие на то, что микромассивы, изготовленные в собственных лабораториях, могут не обеспечивать такой же уровень чувствительности по сравнению с коммерческими олигонуклеотидными массивами, возможно, из-за небольших партий и сниженной эффективности нанесения пятен по сравнению с промышленным производством олиго-массивов. В олигонуклеотидных микромассивах зонды представляют собой короткие последовательности, разработанные для соответствия частям последовательности известных или предполагаемых открытых рамок считывания. Хотя олигонуклеотидные зонды часто используются в микромассивах, полученных методом нанесения пятен, термин "олигонуклеотидный массив" чаще всего относится к конкретной технологии производства. Олигонуклеотидные массивы производятся путем нанесения коротких олигонуклеотидных последовательностей, предназначенных для представления одного гена или семейства вариантов сплайсинга генов, путем синтеза этой последовательности непосредственно на поверхности массива вместо нанесения целых последовательностей. Последовательности могут быть длиннее (60-мерные зонды, такие как дизайн Agilent) или короче (25-мерные зонды, производимые Affymetrix), в зависимости от желаемой цели; более длинные зонды более специфичны для отдельных генов-мишеней, а более короткие зонды могут быть нанесены пятнами с более высокой плотностью по всему массиву и дешевле в производстве. Один из методов, используемых для производства олигонуклеотидных массивов, включает фотолитографический синтез (Affymetrix) на подложке из диоксида кремния, где свет и светочувствительные маскирующие агенты используются для "построения" последовательности по одному нуклеотиду за раз по всему массиву. Каждый подходящий зонд избирательно "размаскируется" перед погружением массива в раствор, содержащий один нуклеотид, затем происходит реакция маскировки, и следующий набор зондов размаскируется в подготовку к воздействию другого нуклеотида. После многих повторений последовательности каждого зонда полностью конструируются. В последнее время технология Maskless Array Synthesis от NimbleGen Systems объединила гибкость с большим количеством зондов.

Microarrays can be fabricated using a variety of technologies, including printing with fine pointed pins onto glass slides, photolithography using pre made masks, photolithography using dynamic micromirror devices, ink jet printing, or electrochemistry on microelectrode arrays. In spotted microarrays, the probes are oligonucleotides, cDNA or small fragments of PCR products that correspond to mRNAs. The probes are synthesized prior to deposition on the array surface and are then "spotted" onto glass. A common approach utilizes an array of fine pins or needles controlled by a robotic arm that is dipped into wells containing DNA probes and then depositing each probe at designated locations on the array surface. The resulting "grid" of probes represents the nucleic acid profiles of the prepared probes and is ready to receive complementary cDNA or cRNA "targets" derived from experimental or clinical samples. This technique is used by research scientists around the world to produce "in house" printed microarrays in their own labs. These arrays may be easily customized for each experiment, because researchers can choose the probes and printing locations on the arrays, synthesize the probes in their own lab (or collaborating facility), and spot the arrays. They can then generate their own labeled samples for hybridization, hybridize the samples to the array, and finally scan the arrays with their own equipment. This provides a relatively low cost microarray that may be customized for each study, and avoids the costs of purchasing often more expensive commercial arrays that may represent vast numbers of genes that are not of interest to the investigator. Publications exist which indicate in house spotted microarrays may not provide the same level of sensitivity compared to commercial oligonucleotide arrays, possibly owing to the small batch sizes and reduced printing efficiencies when compared to industrial manufactures of oligo arrays. In oligonucleotide microarrays, the probes are short sequences designed to match parts of the sequence of known or predicted open reading frames. Although oligonucleotide probes are often used in "spotted" microarrays, the term "oligonucleotide array" most often refers to a specific technique of manufacturing. Oligonucleotide arrays are produced by printing short oligonucleotide sequences designed to represent a single gene or family of gene splice variants by synthesizing this sequence directly onto the array surface instead of depositing intact sequences. Sequences may be longer (60 mer probes such as the Agilent design) or shorter (25 mer probes produced by Affymetrix) depending on the desired purpose; longer probes are more specific to individual target genes, shorter probes may be spotted in higher density across the array and are cheaper to manufacture. One technique used to produce oligonucleotide arrays include photolithographic synthesis (Affymetrix) on a silica substrate where light and light sensitive masking agents are used to "build" a sequence one nucleotide at a time across the entire array. Each applicable probe is selectively "unmasked" prior to bathing the array in a solution of a single nucleotide, then a masking reaction takes place and the next set of probes are unmasked in preparation for a different nucleotide exposure. After many repetitions, the sequences of every probe become fully constructed. More recently, Maskless Array Synthesis from NimbleGen Systems has combined flexibility with large numbers of probes.

Типичный протокол

Это пример эксперимента с ДНК-микромассивом, включающий подробную информацию для конкретного случая, чтобы лучше объяснить эксперименты с ДНК-микромассивами, одновременно перечисляя модификации для РНК или других альтернативных экспериментов. Два образца, подлежащие сравнению (попарное сравнение), выращиваются/получаются. В данном примере – обработанный образец (случай) и необработанный образец (контроль). Интересующая нуклеиновая кислота очищается: это может быть РНК для профилирования экспрессии, ДНК для сравнительной гибридизации или ДНК/РНК, связанная с определенным белком, который подвергается иммунопреципитации (ChIP-on-chip) для эпигенетических или регуляторных исследований. В этом примере общая РНК (ядерная и цитоплазматическая) изолируется экстракцией фенол-хлороформом-тиоцианатом гуанидина (например, Trizol), которая изолирует большую часть РНК (в то время как колоночные методы имеют порог в 200 нуклеотидов) и, при правильном выполнении, обеспечивает более высокую чистоту. Очищенная РНК анализируется на качество (капиллярным электрофорезом) и количество (например, с помощью спектрометра NanoDrop или NanoPhotometer). Если материал имеет приемлемое качество и присутствует в достаточном количестве (например, >1 мкг, хотя требуемое количество варьируется в зависимости от платформы микромассива), эксперимент может быть продолжен. Меченый продукт генерируется посредством обратной транскрипции с последующей необязательной амплификацией ПЦР. РНК обратной транскрибируется либо олиго(dT)-праймерами (которые усиливают только мРНК), либо случайными праймерами (которые усиливают всю РНК, большая часть которой является рРНК). Микромассивы для микроРНК лигируют олигонуклеотид к очищенной малой РНК (изолированной с помощью фракционирования), которая затем обратной транскрибируется и амплифицируется. Метка добавляется либо во время обратной транскрипции, либо после амплификации, если она выполняется. Направление мечения зависит от микромассива; например, если метка добавляется вместе с RT-смесью, кДНК является антисмысловой, а зонд микромассива – смысловой, за исключением случаев отрицательных контролей. Метка обычно флуоресцентная; только одна машина использует радиоактивные метки. Мечение может быть прямым (не используется) или косвенным (требует стадии конъюгации). Для двухканальных микромассивов стадия конъюгации происходит до гибридизации с использованием аминоаллилуридинтрифосфата (аминоаллилового UTP или aaUTP) и аминореактивных красителей NHS (таких как цианиновые красители); для одноканальных микромассивов стадия конъюгации происходит после гибридизации с использованием биотина и меченого стрептавидина. Модифицированные нуклеотиды (обычно в соотношении 1 aaUTP: 4 TTP (тимидинтрифосфат)) добавляются ферментативно в низком соотношении к нормальным нуклеотидам, обычно приводя к 1 на каждые 60 оснований. Затем aaДНК очищается с помощью колонки (с использованием фосфатного буфера, так как Tris содержит аминогруппы). Аминоаллильная группа – это аминогруппа на длинном линкере, прикрепленном к нуклеобазе, которая реагирует с реактивным красителем. Для контроля артефактов красителя в двухканальных экспериментах может быть выполнена форма репликации, известная как переключение красителей (dye flip); при переключении красителей используется второй слайд с измененными метками (образец, который был помечен Cy3 на первом слайде, помечен Cy5 и наоборот). В этом примере аминоаллиловый UTP присутствует в смеси, полученной обратной транскрипцией. Затем меченые образцы смешиваются с запатентованным гибридизационным раствором, который может состоять из SDS, SSC, декстрансульфата, блокирующего агента (такого как ДНК Cot 1, ДНК спермы лосося, ДНК тимуса телят, PolyA или PolyT), раствора Денхардта или формамина. Смесь денатурируется и добавляется в отверстия микромассива. Отверстия герметизируются, и микромассив гибридизируется либо в гибридизационной печи (hyb oven), где микромассив перемешивается вращением, либо в смесителе, где микромассив перемешивается переменным давлением в отверстиях. После ночной гибридизации все неспецифические связи смываются (SDS и SSC). Микромассив сушится и сканируется машиной, которая использует лазер для возбуждения красителя и измеряет уровни эмиссии с помощью детектора. Изображение выравнивается по шаблону, и интенсивность каждой характеристики (состоящей из нескольких пикселей) количественно оценивается. Сырые данные нормализуются; самый простой метод нормализации – вычитание фоновой интенсивности и масштабирование так, чтобы общая интенсивность характеристик двух каналов была одинаковой, или использование интенсивности референсного гена для расчета t-значения для всех интенсивностей. Более сложные методы включают z-отношение, регрессию loess и lowess, а также RMA (robust multichip analysis) для чипов Affymetrix (одноканальные, кремниевые чипы, олигонуклеотиды короткой длины, синтезированные in situ).

This is an example of a DNA microarray experiment which includes details for a particular case to better explain DNA microarray experiments, while listing modifications for RNA or other alternative experiments. The two samples to be compared (pairwise comparison) are grown/acquired. In this example treated sample (case) and untreated sample (control). The nucleic acid of interest is purified: this can be RNA for expression profiling, DNA for comparative hybridization, or DNA/RNA bound to a particular protein which is immunoprecipitated (ChIP on chip) for epigenetic or regulation studies. In this example total RNA is isolated (both nuclear and cytoplasmic) by Guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction (e. g. Trizol) which isolates most RNA (whereas column methods have a cut off of 200 nucleotides) and if done correctly has a better purity. The purified RNA is analysed for quality (by capillary electrophoresis) and quantity (for example, by using a NanoDrop or NanoPhotometer spectrometer). If the material is of acceptable quality and sufficient quantity is present (e. g., >1μg, although the required amount varies by microarray platform), the experiment can proceed. The labeled product is generated via reverse transcription and followed by an optional PCR amplification. The RNA is reverse transcribed with either polyT primers (which amplify only mRNA) or random primers (which amplify all RNA, most of which is rRNA). miRNA microarrays ligate an oligonucleotide to the purified small RNA (isolated with a fractionator), which is then reverse transcribed and amplified. The label is added either during the reverse transcription step, or following amplification if it is performed. The sense labeling is dependent on the microarray; e. g. if the label is added with the RT mix, the cDNA is antisense and the microarray probe is sense, except in the case of negative controls. The label is typically fluorescent; only one machine uses radiolabels. The labeling can be direct (not used) or indirect (requires a coupling stage). For two channel arrays, the coupling stage occurs before hybridization, using aminoallyl uridine triphosphate (aminoallyl UTP, or aaUTP) and NHS amino reactive dyes (such as cyanine dyes); for single channel arrays, the coupling stage occurs after hybridization, using biotin and labeled streptavidin. The modified nucleotides (usually in a ratio of 1 aaUTP: 4 TTP (thymidine triphosphate)) are added enzymatically in a low ratio to normal nucleotides, typically resulting in 1 every 60 bases. The aaDNA is then purified with a column (using a phosphate buffer solution, as Tris contains amine groups). The aminoallyl group is an amine group on a long linker attached to the nucleobase, which reacts with a reactive dye. A form of replicate known as a dye flip can be performed to control for dye artifacts in two channel experiments; for a dye flip, a second slide is used, with the labels swapped (the sample that was labeled with Cy3 in the first slide is labeled with Cy5, and vice versa). In this example, aminoallyl UTP is present in the reverse transcribed mixture. The labeled samples are then mixed with a proprietary hybridization solution which can consist of SDS, SSC, dextran sulfate, a blocking agent (such as Cot 1 DNA, salmon sperm DNA, calf thymus DNA, PolyA, or PolyT), Denhardt's solution, or formamine. The mixture is denatured and added to the pinholes of the microarray. The holes are sealed and the microarray hybridized, either in a hyb oven, where the microarray is mixed by rotation, or in a mixer, where the microarray is mixed by alternating pressure at the pinholes. After an overnight hybridization, all nonspecific binding is washed off (SDS and SSC). The microarray is dried and scanned by a machine that uses a laser to excite the dye and measures the emission levels with a detector. The image is gridded with a template and the intensities of each feature (composed of several pixels) is quantified. The raw data is normalized; the simplest normalization method is to subtract background intensity and scale so that the total intensities of the features of the two channels are equal, or to use the intensity of a reference gene to calculate the t value for all of the intensities. More sophisticated methods include z ratio, loess and lowess regression and RMA (robust multichip analysis) for Affymetrix chips (single channel, silicon chip, in situ synthesized short oligonucleotides).

Микромассивы и биоинформатика

Появление недорогих экспериментов с использованием микромассивов породило ряд специфических задач биоинформатики: множественные уровни репликации в дизайне эксперимента (экспериментальный дизайн); разнообразие платформ, независимых групп и форматов данных (стандартизация); статистический анализ данных (анализ данных); сопоставление каждого зонда с измеряемым им мРНК-транскриптом (аннотация); огромный объем данных и необходимость обеспечения их совместного использования (хранение данных).

Экспериментальная конструкция

Из-за биологической сложности экспрессии генов, вопросы экспериментального дизайна, рассматриваемые в статье о профилировании экспрессии, имеют первостепенное значение для получения статистически и биологически достоверных выводов из данных. При планировании эксперимента с использованием микромассивов необходимо учитывать три основных аспекта. Во-первых, репликация биологических образцов необходима для обоснования выводов, сделанных по результатам эксперимента. Во-вторых, технические повторы (например, два образца РНК, полученные из одной экспериментальной единицы) могут помочь оценить точность измерений. Биологические повторы подразумевают независимые выделения РНК, а технические повторы – два аликота из одного и того же выделения. В-третьих, пятна, соответствующие каждому кДНК-клону или олигонуклеотиду, представлены в виде повторов (как минимум дубликатов) на слайде микромассива для оценки технической точности каждой гибридизации. Крайне важно подробно описывать процедуры подготовки и обработки образцов, чтобы правильно идентифицировать независимые единицы в эксперименте и избежать необоснованно завышенных оценок статистической значимости.

Стандартизация

Обмен данными микромассивов затруднен из-за отсутствия стандартизации в производстве платформ, протоколах проведения экспериментов и методах анализа. Это создает проблему совместимости в биоинформатике. Различные инициативы с открытым исходным кодом стремятся упростить обмен и анализ данных, полученных на непатентованных чипах.

Например, контрольный список "Минимальная информация об эксперименте с микромассивами" (MIAME) помогает определить необходимый уровень детализации и внедряется многими журналами как требование к публикациям, содержащим результаты, полученные с помощью микромассивов. Однако MIAME не определяет формат представления информации, поэтому, хотя многие форматы могут соответствовать требованиям MIAME, на данный момент ни один из них не обеспечивает проверку полного семантического соответствия. Проект "Контроль качества микромассивов" (MAQC) реализуется Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) с целью разработки стандартов и показателей контроля качества, которые в конечном итоге позволят использовать данные микромассивов в разработке лекарств, клинической практике и принятии нормативных решений. Общество MGED разработало стандарты для представления результатов экспериментов по экспрессии генов и соответствующих аннотаций.

Анализ данных

Наборы данных микромассивов обычно очень велики, и аналитическая точность зависит от множества переменных. К статистическим задачам относится учет влияния фонового шума и соответствующая нормализация данных. Методы нормализации могут быть адаптированы к конкретным платформам, а в случае коммерческих платформ анализ может быть проприетарным. Алгоритмы, влияющие на статистический анализ, включают:

Анализ изображений: создание сетки, распознавание пятен на сканированном изображении (алгоритм сегментации), удаление или маркировка низкокачественных и малоинтенсивных элементов (так называемое флагирование). Обработка данных: вычитание фона (на основе глобального или локального фона), определение интенсивности пятен и соотношений интенсивностей, визуализация данных (например, график MA), логарифмическое преобразование соотношений, глобальная или локальная нормализация соотношений интенсивностей и сегментация на различные области числа копий с использованием алгоритмов обнаружения переходов. Анализ выявления классов: Этот аналитический подход, иногда называемый неконтролируемой классификацией или поиском знаний, пытается определить, группируются ли микромассивы (объекты, пациенты, мыши и т. д.) или гены в группы. Выявление естественных групп объектов (микромассивов или генов), которые объединяются в кластеры, может способствовать обнаружению новых групп, существование которых ранее было неизвестно. В процессе поиска знаний различные методы неконтролируемой классификации могут применяться к данным микромассивов ДНК для выявления новых кластеров (классов) массивов. Этот подход не основан на гипотезах, а базируется на итеративном распознавании закономерностей или методах статистического обучения для поиска "оптимального" количества кластеров в данных. Примеры методов неконтролируемого анализа включают самоорганизующиеся карты, нейронный газ, кластерный анализ k-средних, иерархический кластерный анализ, кластеризация на основе обработки геномных сигналов и кластерный анализ на основе моделей. Для некоторых из этих методов пользователю также необходимо определить меру расстояния между парами объектов. Хотя обычно используется коэффициент корреляции Пирсона, в литературе было предложено и оценено несколько других мер. Входные данные, используемые в анализе выявления классов, обычно основаны на списках генов с высокой информативностью (низким уровнем шума), основанных на низких значениях коэффициента вариации или высоких значениях энтропии Шеннона и т. д. Определение наиболее вероятного или оптимального числа кластеров, полученных в результате неконтролируемого анализа, называется валидностью кластеризации. Некоторые часто используемые метрики для валидности кластеризации – индекс силуэта, индекс Дэвиса – Боулдина, индекс Данна или статистика Хьюберта. Анализ предсказания класса: Этот подход, называемый контролируемой классификацией, закладывает основу для разработки прогностической модели, в которую можно вводить будущие неизвестные тестовые объекты для предсказания наиболее вероятной принадлежности к классу тестовых объектов. Контролируемый анализ включает методы теста Манна – Уитни, адаптированные к наборам данных микромассивов, которые учитывают множественные сравнения или кластерный анализ. Эти методы оценивают статистическую мощность на основе вариабельности данных и количества экспериментальных повторов и могут помочь минимизировать ошибки I и II рода в анализах. Уменьшение размерности: аналитики часто уменьшают количество измерений (генов) перед анализом данных. Анализ взвешенной сети совместной экспрессии генов широко используется для выявления модулей совместной экспрессии и внутримодульных генов-хабов. Модули могут соответствовать типам клеток или путям. Высокосвязанные внутримодульные хабы наилучшим образом представляют свои соответствующие модули. Данные микромассивов могут потребовать дальнейшей обработки, направленной на уменьшение размерности данных для облегчения понимания и более целенаправленного анализа. Другие методы позволяют анализировать данные, состоящие из небольшого количества биологических или технических повторов; например, тест локального объединенного отклонения (LPE) объединяет стандартные отклонения генов с аналогичными уровнями экспрессии в попытке компенсировать недостаточную репликацию.

Image analysis: gridding, spot recognition of the scanned image (segmentation algorithm), removal or marking of poor quality and low intensity features (called flagging). Data processing: background subtraction (based on global or local background), determination of spot intensities and intensity ratios, visualisation of data (e. g. see MA plot), and log transformation of ratios, global or local normalization of intensity ratios, and segmentation into different copy number regions using step detection algorithms. Class discovery analysis: This analytic approach, sometimes called unsupervised classification or knowledge discovery, tries to identify whether microarrays (objects, patients, mice, etc.) or genes cluster together in groups. Identifying naturally existing groups of objects (microarrays or genes) which cluster together can enable the discovery of new groups that otherwise were not previously known to exist. During knowledge discovery analysis, various unsupervised classification techniques can be employed with DNA microarray data to identify novel clusters (classes) of arrays. This type of approach is not hypothesis driven, but rather is based on iterative pattern recognition or statistical learning methods to find an "optimal" number of clusters in the data. Examples of unsupervised analyses methods include self organizing maps, neural gas, k means cluster analyses, hierarchical cluster analysis, Genomic Signal Processing based clustering and model based cluster analysis. For some of these methods the user also has to define a distance measure between pairs of objects. Although the Pearson correlation coefficient is usually employed, several other measures have been proposed and evaluated in the literature. The input data used in class discovery analyses are commonly based on lists of genes having high informativeness (low noise) based on low values of the coefficient of variation or high values of Shannon entropy, etc. The determination of the most likely or optimal number of clusters obtained from an unsupervised analysis is called cluster validity. Some commonly used metrics for cluster validity are the silhouette index, Davies Bouldin index, Dunn's index, or Hubert's statistic. Class prediction analysis: This approach, called supervised classification, establishes the basis for developing a predictive model into which future unknown test objects can be input in order to predict the most likely class membership of the test objects. Supervised analysisMann–Whitney test methods tailored to microarray data sets, which take into account multiple comparisons or cluster analysis. These methods assess statistical power based on the variation present in the data and the number of experimental replicates, and can help minimize Type I and type II errors in the analyses. Dimensional reduction: Analysts often reduce the number of dimensions (genes) prior to data analysis. Weighted gene co expression network analysis is widely used for identifying co expression modules and intramodular hub genes. Modules may corresponds to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs best represent their respective modules. Microarray data may require further processing aimed at reducing the dimensionality of the data to aid comprehension and more focused analysis. Other methods permit analysis of data consisting of a low number of biological or technical replicates; for example, the Local Pooled Error (LPE) test pools standard deviations of genes with similar expression levels in an effort to compensate for insufficient replication.

Аннотация

Отношение между зондом и мРНК, которую он предназначен обнаруживать, не является простым. Некоторые мРНК могут неспецифически гибридизоваться с зондами в массиве, предназначенными для обнаружения другой мРНК. Кроме того, мРНК могут подвергаться предвзятости при амплификации, зависящей от последовательности или конкретной молекулы. Наконец, зонды, разработанные для обнаружения мРНК определенного гена, могут основываться на геномной EST-информации, ошибочно ассоциированной с этим геном.

Хранение данных

Данные, полученные с помощью микромассивов, оказались более полезными по сравнению с другими аналогичными наборами данных. Большой объем данных, специализированные форматы (такие как MIAME) и усилия по их обработке и систематизации требуют использования специализированных баз данных для хранения. Для интеграции разнородных биологических наборов данных и поддержки анализа было разработано несколько решений для хранения данных с открытым исходным кодом, таких как InterMine и BioMart.

Альтернативные технологии

Прогресс в области массово-параллельного секвенирования привел к разработке технологии RNA-Seq, которая позволяет применять метод «дробовика» для анализа всего транскриптома с целью характеристики и количественной оценки экспрессии генов. В отличие от микрочипов, для которых требуется наличие референсного генома и транскриптома до разработки самого микрочипа, RNA-Seq также может быть использован для новых модельных организмов, геномы которых еще не секвенированы.