Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Механикалық процесс
Mechanical process
Центрифугация – бұл ерітіндіден бөлшектерді олардың мөлшеріне, пішініне, тығыздығына, ортаның тұтқырлығына және ротордың айналу жылдамдығына сәйкес бөлу үшін центрифугалық күшті пайдаланатын механикалық процесс. Центрифугация жылдамдығы әдетте минутына айналымдар (RPM) түрінде берілетін бұрыштық жылдамдықпен немесе g түрінде берілетін үдеумен сипатталады. RPM мен g арасындағы түрлендіру коэффициенті центрифуга роторының радиусына байланысты. Центрифугация кезінде бөлшектердің шөгу жылдамдығы олардың мөлшері мен пішініне, центрифугалық үдеуге, қатты заттардың көлемдік үлесіне, бөлшек пен сұйықтық арасындағы тығыздық айырмашылығына және тұтқырлыққа байланысты. Көбінесе қолданылатыны – қатты заттарды жоғары концентрациялы суспензиялардан бөлу, ол сарқынды судың шламын сусыздандыру үшін қолданылады, онда нашар тұрақты тұнба түзіледі. Центрифугациялау әдісі өнеркәсіптік және зертханалық қолдану салаларында кеңінен қолданылады; бұл процесс екі араласатын затты бөлу үшін ғана емес, сонымен қатар макромолекулалардың гидродинамикалық қасиеттерін талдау үшін де пайдаланылады. Бұл биохимия, жасуша және молекулалық биологиядағы ең маңызды және көп қолданылатын зерттеу әдістерінің бірі. Химия және тамақ өнеркәсібінде арнайы центрифугалар бөлшектердің үздіксіз ағынын плазма сияқты сұйықтыққа айналдыра алады. Центрифугация – уранды байыту үшін ең көп қолданылатын әдіс, ол уран гексафториді газындағы U 238 және U 235 атомдарының арасындағы шамалы масса айырмашылығына негізделген.
Centrifugation is a mechanical process which involves the use of the centrifugal force to separate particles from a solution according to their size, shape, density, medium viscosity and rotor speed. The rate of centrifugation is specified by the angular velocity usually expressed as revolutions per minute (RPM), or acceleration expressed as g. The conversion factor between RPM and g depends on the radius of the centrifuge rotor. The particles' settling velocity in centrifugation is a function of their size and shape, centrifugal acceleration, the volume fraction of solids present, the density difference between the particle and the liquid, and the viscosity. The most common application is the separation of solid from highly concentrated suspensions, which is used in the treatment of sewage sludges for dewatering where less consistent sediment is produced. The centrifugation method has a wide variety of industrial and laboratorial applications; not only is this process used to separate two miscible substances, but also to analyze the hydrodynamic properties of macromolecules. It is one of the most important and commonly used research methods in biochemistry, cell and molecular biology. In the chemical and food industries, special centrifuges can process a continuous stream of particle turning into separated liquid like plasma. Centrifugation is also the most common method used for uranium enrichment, relying on the slight mass difference between atoms of U 238 and U 235 in uranium hexafluoride gas.
Микроцентрифугалар
Микроцентрифугалар – арнайы жасалған, үстел үстіне қойылатын, жеңіл және шағын көлемді роторлары бар модельдер. Олар шамамен 17 000 айналымға дейін өте жылдам үдеуге қабілетті. Бұл құрылғылар негізінен 0,2–2,0 мл көлеміндегі сынамаларды қысқа мерзімге центрифугалау үшін қолданылады. Алайда, олардың кіші өлшемділігіне байланысты, оларды оңай тасымалдауға болады және қажет болған жағдайда суық бөлмеде пайдалануға болады. Жоғары жылдамдықта жұмыс істеуге арналған микроцентрифугалар 35 000 айналымға дейін жете алады, бұл 30 000×g дейін RCF мәнін береді және олар жоғары жылдамдықты микроцентрифугалар деп аталады.
Microcentrifuges are specially designed table top models with light, small volume rotors capable of very fast acceleration up to approximately 17,000 rpm. They are lightweight devices which are primarily used for short time centrifugation of samples up to around 0.2–2.0 mL. However, due to their small scale, they are readily transportable and, if necessary, can be operated in a cold room. Microcentrifuges designed for high speed operation can reach up to 35,000 rpm, giving RCF up to 30000×g, and are called high speed microcentrifuges.
Төмен жылдамдықты центрифугалар
Төмен жылдамдықтағы центрифугалар химиялық шөгінділерді, толық жасушаларды (жануарлар, өсімдіктер және кейбір микроорганизмдер), ядроларды, хлоропластарды, ірі митохондрияларды және үлкен плазмалық мембрана фрагменттерін жинау үшін пайдаланылады. Жасушаларды тазартуға арналған тығыздық градиенттері де осы центрифугаларда қолданылады. Адапторлардың көмегімен үлгінің көлемін өзгертуге болатындықтан, айналмалы қаптарлы роторлар өте кеңінен қолданылады.
Low speed centrifuges are used to harvest chemical precipitates, intact cells (animal, plant and some microorganisms), nuclei, chloroplasts, large mitochondria and the larger plasma membrane fragments. Density gradients for purifying cells are also run in these centrifuges. Swinging bucket rotors tend to be used very widely because of the huge flexibility of sample size through the use of adaptors.
Жоғары жылдамдықты центрифугалар
Жоғары жылдамдықты центрифугалар микроорганизмдерді, вирустарды, митохондрияларды, лизосомаларды, пероксисомаларды және толыққанды түтікшелі Голджи мембраналарын жинау үшін әдетте қолданылады. Көптеген қарапайым шөгінді түсіру жұмыстары бұрышты роторларда орындалады. Жасұюларды және органеллаларды тазарту үшін тығыздық градиентін қолдану жұмыстарының бір бөлігі айналмалы роторларда немесе Перколл градиенттері болған жағдайда, бұрышты роторларда жүргізіледі. Олар плазмалық мембранадан, эндоплазмалық тордан (ЭР) және Голджи мембранасынан шыққан барлық мембраналық көпіршіктерді, эндосомаларды, рибосомаларды, рибосомалық субъединицаларды, плазмидтерді, ДНК, РНК және белоктарды бұрышты роторларда жинау үшін қолданылады. Олар жасушалардан басқа барлық бөлшектерді тығыздық градиенті арқылы тазарту үшін ең көп қолданылатын центрифуга болып табылады. Айналмалы роторлар дәстүрлі түрде осы мақсатта қолданылғанмен, бұрышты роторлар мен тік роторлар да қолданылады, әсіресе өздігінен қалыптасқан градиенттер үшін, және бұл бөлу тиімділігін едәуір арттыра алады. Ультрацентрифугалардың екі түрі бар: аналитикалық және дайындық.
High speed centrifuges are typically used to harvest microorganisms, viruses, mitochondria, lysosomes, peroxisomes and intact tubular Golgi membranes. The majority of the simple pelleting tasks are carried out in fixed angle rotors. Some density gradient work for purifying cells and organelles can be carried out in swinging bucket rotors, or in the case of Percoll gradients in fixed angle rotors. They are used to harvest all membrane vesicles derived from the plasma membrane, endoplasmic reticulum (ER) and Golgi membrane, endosomes, ribosomes, ribosomal subunits, plasmids, DNA, RNA and proteins in fixed angle rotors. They are the most commonly used centrifuge for the density gradient purification of all particles except cells, and, whilst swinging buckets have been traditionally used for this purpose, fixed angle rotors and vertical rotors are also used, particularly for self generated gradients and can improve the efficiency of separation greatly. There are two kinds of ultracentrifuges: the analytical and the preparative.
Аналитикалық ультрацентрифугация
Аналитикалық ультрацентрифугация (АУК) макромолекулалардың пішіні, массасы, құрамы және конформациясы сияқты қасиеттерін анықтау үшін қолданылуы мүмкін. Бұл үлгінің тазалығын бағалау, биомолекулалық кешендердің құрастыру және ыдырау механизмдерін сипаттау, суббұрындық стехиометриясын анықтау, макромолекулалық конформациялық өзгерістерді анықтау және сипаттау, өзін-өзі және гетеро-бірлесетін жүйелер үшін тепе-теңдік тұрақтылары мен термодинамикалық параметрлерді есептеу үшін қолданылатын, кең таралған биомолекулалық талдау әдісі. Аналитикалық ультрацентрифугалар айналу кезінде үлгінің қозғалысын нақты уақыт режимінде бақылау үшін сканерлеу арқылы көрінетін/күлгін сәулелі жарықпен оптикалық анықтау жүйесін қамтиды. Үлгілер сахароза, цезий хлориді немесе йодтануол сияқты жоғары тығыздық ерітіндісімен центрифугаланады. Жоғары тығыздық ерітіндісі сынақ түтігінде біркелкі концентрацияда ("жақтау") немесе өзгеретін концентрацияда ("градиент") болуы мүмкін. Молекулалық қасиеттер шөгінді жылдамдығын талдау немесе шөгінді тепе-теңдігін талдау арқылы модельделуі мүмкін. Талдау барысында бөлшектер немесе молекулалар физикалық қасиеттері мен ерітіндінің қасиеттеріне байланысты әртүрлі жылдамдықпен сынақ түтігі арқылы қозғалып, ақырында түтіктің түбінде шөгінді немесе әртүрлі биіктіктегі жолақтар түзеді.
Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used for determination of the properties of macromolecules such as shape, mass, composition, and conformation. It is a commonly used biomolecular analysis technique used to evaluate sample purity, to characterize the assembly and disassembly mechanisms of biomolecular complexes, to determine subunit stoichiometries, to identify and characterize macromolecular conformational changes, and to calculate equilibrium constants and thermodynamic parameters for self associating and hetero associating systems. Analytical ultracentrifuges incorporate a scanning visible/ultraviolet light based optical detection system for real time monitoring of the sample’s progress during a spin. Samples are centrifuged with a high density solution such as sucrose, caesium chloride, or iodixanol. The high density solution may be at a uniform concentration throughout the test tube ("cushion") or a varying concentration ("gradient"). Molecular properties can be modeled through sedimentation velocity analysis or sedimentation equilibrium analysis. During the run, the particle or molecules will migrate through the test tube at different speeds depending on their physical properties and the properties of the solution, and eventually form a pellet at the bottom of the tube, or bands at various heights.
Дайындықтық ультрацентрифугация
Препаративтік ультрацентрифугалар көбінесе бөлшектерді олардың тығыздықтарына сәйкес бөлу, пеллетке жиналатын тығыз бөлшектерді оқшаулау және/немесе жинау, сондай-ақ бөлшектер бар суспензияларды тазалау үшін қолданылады. Зерттеушілерге құралдағы ротордың түрін өзгертуге икемділік қажет болған жағдайда, олар препаративтік ультрацентрифугаларды да пайдаланады. Препаративтік ультрацентрифугалар әртүрлі ротор түрлерімен жабдықталуы мүмкін, олар әртүрлі сандағы үлгілерді, әртүрлі бұрыштарда және әртүрлі жылдамдықтарда айналдыра алады. Кез келген лизаттың ерітілген фракциясын одан әрі әртүрлі әдістер арқылы оның құрамына бөлуге болады.
Preparative ultracentrifuges are often used for separating particles according to their densities, isolating and/or harvesting denser particles for collection in the pellet, and clarifying suspensions containing particles. Sometimes researchers also use preparative ultracentrifuges if they need the flexibility to change the type of rotor in the instrument. Preparative ultracentrifuges can be equipped with a wide range of different rotor types, which can spin samples of different numbers, at different angles, and at different speeds. The soluble fraction of any lysate can then be further separated into its constituents using a variety of methods.
Тарих
1923 жылы Теодор Сведберг және оның шәкірті Х. Ринде ірі дәнді сольдерді гравитациялық тұнбалану арқылы сәтті талдады. Сольдер – басқа заттардың ішінде біркелкі таратылған заттардан тұрады, олар коллоидтар деп те аталады. Дегенмен, алтын сияқты ұсақ дәнді сольдерді талдау мүмкін болмады. Сол кезде зерттелген бір ақуыз – гемоглобин еді. Оның құрамында 712 көміртек, 1130 сутек, 243 оттек, екі күкірт атомы және кем дегенде бір темір атомы бар екені анықталды. Бұл гемоглобиннің салмағы шамамен 16 000 дальтон (Да) құрады, бірақ бұл мәннің бір немесе төрт еселігі белгісіз болды (темір атомдарының санына байланысты). Тұнбалану тепе-теңдігі әдісін пайдалана отырып жүргізілген тәжірибелер сериясы екі маңызды мәліметті көрсетті: гемоглобиннің молекулалық салмағы 68 000 Да, яғни онда бір емес, төрт темір атомы бар, сондай-ақ гемоглобин қайдан оқшауланғанына қарамастан, әрқашан бірдей молекулалық салмаққа ие. Мұндай үлкен молекулалық массаның денеде қай жерден алынғанына қарамастан, тұрақты түрде табылуы бұрын-соңды болмаған жағдай еді және ақуыздар коллоидтар емес, макромолекулалар деген пікірді қолдады. Бұл құбылысты зерттеу үшін одан да жоғары жылдамдықты центрифуга қажет болды, сондықтан тұнбалану диффузиясы теориясын қолдану үшін ультрацентрифуга жасалды. Соның нәтижесінде, молекулалық массасы бірдей екені анықталды, ал таралу шекарасының болуы оның бір ғана тығыз бөлшек екенін көрсетті. Центрифугалау әдісін одан әрі қолдану, ірі біртекті бөлшектерді әртүрлі жағдайларда дискретті кіші бөліктерге бөлуге болатынын көрсетті. Центрифугалаудың дамуы – эксперименттік протеиндер ғылымындағы маңызды жетістік болды. 1937 жылы Линдерсторм Ланг тығыздық градиенті түтікшелерін тығыздық өлшеулер үшін пайдалануға болатынын ашты. Ол мұны картоптың сары жапырақ вирусымен жұмыс істеген кезде анықтады. Бұл әдіс Месселсон мен Штальдың танымал тәжірибесінде де қолданылды, онда олар әртүрлі азот изотоптарын пайдалана отырып, ДНК репликациясының жартылай консервативті екенін дәлелдеді. Олар тығыздық градиентін центрифугалау арқылы репликация циклінен кейін ДНК-да қандай азот изотопы немесе изотоптары бар екенін анықтады.
By 1923 Theodor Svedberg and his student H. Rinde had successfully analyzed large grained sols in terms of their gravitational sedimentation. Sols consist of a substance evenly distributed in another substance, also known as a colloid. However, smaller grained sols, such as those containing gold, could not be analyzed. One protein being investigated at the time was hemoglobin. It was determined to have 712 carbon, 1,130 hydrogen, 243 oxygen, two sulfur atoms, and at least one iron atom. This gave hemoglobin a resulting weight of approximately 16,000 dalton (Da) but it was uncertain whether this value was a multiple of one or four (dependent upon the number of iron atoms present). Through a series of experiments utilizing the sedimentation equilibrium technique, two important observations were made: hemoglobin has a molecular weight of 68,000 Da, suggesting that there are four iron atoms present rather than one, and that, no matter where the hemoglobin was isolated from, it had exactly the same molecular weight. How something of such a large molecular mass could be consistently found, regardless of where it was sampled from in the body, was unprecedented and favored the idea that proteins are macromolecules rather than colloids. In order to investigate this phenomenon, a centrifuge with even higher speeds was needed, and thus the ultracentrifuge was created to apply the theory of sedimentation diffusion. The same molecular mass was determined, and the presence of a spreading boundary suggested that it was a single compact particle. Further application of centrifugation showed that under different conditions the large homogeneous particles could be broken down into discrete subunits. The development of centrifugation was a great advance in experimental protein science. Linderstorm Lang, in 1937, discovered that density gradient tubes could be used for density measurements. He discovered this when working with potato yellow dwarf virus. This method was also used in Meselson and Stahl's famous experiment in which they proved that DNA replication is semi conservative by using different isotopes of nitrogen. They used density gradient centrifugation to determine which isotope or isotopes of nitrogen were present in the DNA after cycles of replication.