Введение
Механический процесс
Центрифугирование – это механический процесс, в котором используется центробежная сила для разделения частиц из раствора в зависимости от их размера, формы, плотности, вязкости среды и скорости вращения ротора. Скорость центрифугирования задается угловой скоростью, обычно выражаемой в оборотах в минуту (RPM), или ускорением, выражаемым в g. Коэффициент пересчета между RPM и g зависит от радиуса ротора центрифуги. Скорость осаждения частиц при центрифугировании является функцией их размера и формы, центробежного ускорения, объемной доли твердых веществ, разницы в плотности между частицей и жидкостью, а также вязкости. Наиболее распространенным применением является разделение твердых веществ от высококонцентрированных суспензий, которое используется при обработке осадка сточных вод для обезвоживания, где образуется менее однородный осадок. Метод центрифугирования имеет широкий спектр промышленных и лабораторных применений; этот процесс используется не только для разделения двух смешивающихся веществ, но и для анализа гидродинамических свойств макромолекул. Это один из наиболее важных и широко используемых исследовательских методов в биохимии, клеточной и молекулярной биологии. В химической и пищевой промышленности специальные центрифуги могут обрабатывать непрерывный поток частиц, превращая его в разделенную жидкость, например, плазму. Центрифугирование также является наиболее распространенным методом, используемым для обогащения урана, основанным на незначительной разнице в массе между атомами U-238 и U-235 в газе гексафториде урана.
Микроцентрифуги
Микроцентрифуги – это специально разработанные настольные модели с легкими роторами малого объема, способные к очень быстрому ускорению до примерно 17 000 об/мин. Это легкие приборы, которые в основном используются для кратковременного центрифугирования образцов объемом до 0,2–2,0 мл. Однако, благодаря своим компактным размерам, они легко транспортируются и, при необходимости, могут использоваться в холодной камере. Микроцентрифуги, предназначенные для работы на высоких скоростях, могут достигать 35 000 об/мин, обеспечивая RCF до 30000×g, и называются высокоскоростными микроцентрифугами.
Центрифуги малой скорости
Низкоскоростные центрифуги применяются для осаждения химических осадков, целых клеток (животных, растений и некоторых микроорганизмов), ядер, хлоропластов, крупных митохондрий и крупных фрагментов плазматической мембраны. В этих центрифугах также формируют градиенты плотности для очистки клеток. Роторы с маятниковыми ведрами широко используются благодаря возможности работы с образцами различного объема при использовании адаптеров.
Центрифуги высокоскоростные
Высокоскоростные центрифуги обычно используются для осаждения микроорганизмов, вирусов, митохондрий, лизосом, пероксисом и целых трубчатых мембран Гольджи. Большинство простых задач по осаждению выполняются в роторах с фиксированным углом. Некоторые работы с градиентами плотности для очистки клеток и органелл могут проводиться в роторах с качающимися ведрами, или, в случае градиентов Percoll, в роторах с фиксированным углом. Они используются для осаждения всех мембранных везикул, происходящих из плазматической мембраны, эндоплазматической сети (ЭР) и мембраны Гольджи, эндосом, рибосом, субъединиц рибосом, плазмид, ДНК, РНК и белков в роторах с фиксированным углом. Они являются наиболее часто используемыми центрифугами для очистки частиц методом градиента плотности, за исключением клеток, и, хотя для этой цели традиционно используются роторы с качающимися ведрами, также используются роторы с фиксированным углом и вертикальные роторы, особенно для самоформирующихся градиентов, что может значительно повысить эффективность разделения. Существует два вида ультрацентрифуг: аналитические и препаративные.
Аналитическая ультрацентрифугация
Аналитическая ультрацентрифугация (AUC) может использоваться для определения свойств макромолекул, таких как форма, масса, состав и конформация. Это широко применяемый метод биомолекулярного анализа, используемый для оценки чистоты образцов, характеристики механизмов сборки и диссоциации биомолекулярных комплексов, определения стехиометрии субъединиц, идентификации и характеристики макромолекулярных конформационных изменений, а также для расчета констант равновесия и термодинамических параметров самоассоциирующих и гетероассоциирующих систем. Аналитические ультрацентрифуги оснащены оптической системой обнаружения, основанной на сканировании видимого/ультрафиолетового света, для мониторинга в реальном времени хода центрифугирования образца. Образцы центрифугируют в растворах высокой плотности, таких как сахароза, хлорид цезия или йоддиксанол. Раствор высокой плотности может иметь равномерную концентрацию по всей длине пробирки ("подушка") или изменяющуюся концентрацию ("градиент"). Молекулярные свойства могут быть смоделированы с помощью анализа скорости седиментации или анализа равновесия седиментации. В процессе центрифугирования частицы или молекулы мигрируют через пробирку с разной скоростью, зависящей от их физических свойств и свойств раствора, и в конечном итоге формируют осадок на дне пробирки или полосы на различной высоте.
Препаративная ультрацентрифугация
Препаративные ультрацентрифуги часто используются для разделения частиц по плотности, выделения и/или сбора более плотных частиц в осадок, а также для осветления суспензий, содержащих частицы. Иногда исследователи прибегают к использованию препаративных ультрацентрифуг, когда требуется возможность менять тип ротора в приборе. Препаративные ультрацентрифуги могут быть оснащены широким спектром различных типов роторов, позволяющих вращать различное количество образцов под разными углами и с разной скоростью. Растворимую фракцию любого лизата затем можно дополнительно разделить на составляющие с помощью различных методов.
История
К 1923 году Теодор Сведберг и его ученик Х. Ринде успешно проанализировали крупнозернистые золи с точки зрения их гравитационной седиментации. Золь состоит из вещества, равномерно распределенного в другом веществе, также известном как коллоид. Однако более мелкозернистые золи, такие как содержащие золото, не поддавались анализу. Одним из исследуемых в то время белков был гемоглобин. Было установлено, что он содержит 712 атомов углерода, 1130 атомов водорода, 243 атома кислорода, два атома серы и как минимум один атом железа. Это дало гемоглобину вес приблизительно 16 000 дальтонов (Да), но оставалось неясным, является ли это значение кратным единице или четверке (в зависимости от количества атомов железа). В ходе серии экспериментов с использованием метода равновесной седиментации были сделаны два важных наблюдения: молекулярная масса гемоглобина составляет 68 000 Да, что указывает на наличие четырех, а не одного атома железа, и что, независимо от места выделения гемоглобина, его молекулярная масса всегда была одинаковой. Обнаружение вещества с такой большой молекулярной массой, стабильно присутствующего в организме независимо от места отбора проб, было беспрецедентным и подтверждало идею о том, что белки являются макромолекулами, а не коллоидами. Для изучения этого явления требовалась центрифуга с еще более высокими скоростями, и была создана ультрацентрифуга для применения теории седиментационной диффузии. Была подтверждена та же молекулярная масса, а наличие распространяющейся границы свидетельствовало о том, что это единая компактная частица. Дальнейшее центрифугирование показало, что при различных условиях крупные однородные частицы могут распадаться на отдельные субъединицы. Развитие центрифугирования стало значительным прогрессом в экспериментальной белковой науке. Линдерсторм Ланг в 1937 году обнаружил, что градиентные трубки плотности можно использовать для измерения плотности. Он сделал это открытие, работая с вирусом пожелтения картофеля. Этот метод также был использован в знаменитом эксперименте Меселсона и Сталла, в котором они доказали полуконсервативный характер репликации ДНК, используя различные изотопы азота. Они использовали центрифугирование в градиенте плотности для определения того, какие изотопы азота присутствовали в ДНК после циклов репликации.