Введение

Регулирующий комплекс клеточного цикла, APC/C

Анафаза-продвигающий комплекс (также называемый циклосомой или APC/C) — это E3 убиквитинлигаза, которая маркирует белки клеточного цикла-мишени для деградации протеасомой 26S. APC/C представляет собой крупный комплекс из 11–13 субъединиц белка, включающий субъединицы куллина (Apc2) и RING (Apc11), аналогично SCF. Другие части APC/C имеют неизвестные функции, но высоко консервативны. Именно открытие APC/C (и SCF) и их ключевой роли в регуляции клеточного цикла эукариот установило важность протеолиза, опосредованного убиквитином, в клеточной биологии. Убиквитинирование и последующая деградация белка протеасомой, ранее рассматривавшиеся как система, исключительно участвующая в удалении поврежденных белков из клетки, теперь воспринимаются как универсальный регуляторный механизм для передачи сигналов, значимость которого приближается к значимости фосфорилирования белков. В 2014 году APC/C был картирован в 3D с разрешением менее нанометра, что также позволило определить его вторичную структуру. Это открытие может улучшить понимание рака и выявить новые сайты связывания для будущих противораковых препаратов.

Функция

Основная функция APC/C – инициировать переход от метафазы к анафазе, помечая специфические белки для деградации. Три основные мишени для деградации, опосредованной APC/C, – это секюрин и S- и M-циклины. Деградация секюрина высвобождает сепаразу, протеазу. Сепараза затем запускает расщепление когезина – белкового комплекса, который связывает сестринские хроматиды. Во время метафазы сестринские хроматиды соединены неповрежденными комплексами когезина. Когда секюрин подвергается убиквитинированию APC/C и высвобождает сепаразу, которая разрушает когезин, сестринские хроматиды становятся свободными для перемещения к противоположным полюсам в анафазе. APC/C также нацеливает митотические циклины на деградацию, что приводит к инактивации комплексов M CDK (митотической циклин-зависимой киназы) и способствует выходу из митоза и цитокинезу. Ключевыми субстратами APC/C, по-видимому, являются секюрин и циклины типа B. Это свойство сохраняется у млекопитающих и дрожжей. Фактически, дрожжи остаются жизнеспособными в отсутствие APC/C, если устранить необходимость в нацеливании на эти два субстрата.

Подединицы

Существует не так много обширных исследований субъединиц APC/C, которые в основном выполняют роль адаптеров. Исследования субъединиц APC проводятся главным образом на дрожжах, и результаты показывают, что большинство субъединиц APC дрожжей также присутствуют у позвоночных, что указывает на консервацию у эукариот. У позвоночных обнаружено одиннадцать основных субъединиц APC, в то время как у дрожжей – тринадцать. Основные мотивы в субъединицах APC включают тетратрикопептидные (TPR) мотивы и WD40 повторы. Также предполагается, что вариации в этих WD40 доменах приводят к различной специфичности субстрата, что подтверждается недавними данными, свидетельствующими о том, что различные субстраты APC могут напрямую и специфически связываться с Cdc20 и Cdh1/Hct1. В конечном итоге, различия в специфичности определяют время разрушения нескольких мишеней APC во время митоза. CDC20 нацелен на несколько основных субстратов в метафазе, а Cdh1 – на более широкий спектр субстратов в поздней митозе и G1. Особенно важно отметить, что 4 субъединицы APC/C дрожжей почти полностью состоят из множественных повторов 34-аминокислотного тетратрикопептидного (TPR) мотива. Эти TPR-субъединицы – Cdc16, Cdc27, Cdc23 и Apc5 – в основном обеспечивают каркас и поддержку для опосредования других белок-белковых взаимодействий. Показано, что Cdc27 и Cdc23 поддерживают связывание Cdc20 и Cdh1, поскольку мутации в ключевых остатках этих субъединиц приводили к увеличению диссоциации активаторов. Apc10/Doc1, как было показано, способствует связыванию субстратов, опосредуя их взаимодействие с Cdh1 и Cdc20. В частности, CDC20 (также известный как p55CDC, Fizzy или Slp1) инактивирует CDK1 посредством убиквитинирования циклинов типа B. Это приводит к активации Cdh1 (также известный как Fizzy-related, Hct1, Ste9 или Srw1), который взаимодействует с APC в поздней митозе и G1/G0. Cdh1 инактивируется посредством фосфорилирования в фазы S, G2 и ранней M. В эти моменты цикла он не может быть собран. Данные свидетельствуют о том, что APC3 и APC7 служат для рекрутирования Cdh1 к анафазопродвигающему комплексу. Это дополнительно подтверждает, что Cdh1 отвечает за поддержание активности APC во время G1. Для связывания Cdh1 не требуется фосфорилирование APC, фактически, фосфорилирование Cdh1 киназами зависимыми от циклина (Cdks) препятствует его связыванию с APC от фазы S до M. После разрушения M Cdk, высвобождения CDC20 из APC и связывания Cdh1 это может произойти, позволяя активности APC продолжаться при входе в G1.

CDC27/APC3

Одно из субъединиц, демонстрирующих TPR-мотив, CDC27, было идентифицировано как взаимодействующее с белками митотического контрольного пункта, такими как Mad2, p55CDC и BUBR1, что указывает на его возможную роль в регуляции времени наступления фазы M. Имеющиеся данные свидетельствуют о вовлечении CDC27 в образование тройного комплекса с SMAD2/3 и Cdh1, который формируется в ответ на сигнализацию TGFβ. В частности, благодаря взаимодействию с Cdh1, CDC27 потенциально может влиять на аффинность между APC и его активаторами Cdc20 и Cdh1. Исследование предполагает, что TGFβ-индуцированное фосфорилирование Cdc27 усиливает взаимодействие между Cdc27 и Cdh1, который непосредственно участвует в активации APC. CDC27 может выступать в качестве посредника, посредством которого сигнализация TGFβ способна активировать APC. Индуцированное TGFβ гиперфосфорилирование CDC27 привело к повышению активности APC.

CDC23, CDC16, CDC27

CDC23, другая субъединица, содержащая TPR-мотивы, взаимодействует с SWM1, связываясь с D-боксом CLB2. На основании гибридных анализов in vivo и ко-иммунопреципитации in vitro, предполагается, что Cdc16p, Cdc23p и Cdc27p (аналоги в *Saccharomyces cerevisiae*) взаимодействуют и формируют макромолекулярный комплекс. Считается, что общие TPR-мотивы опосредуют эти взаимодействия. Функции Cdc27 и Cdc16 у дрозофилы были изучены с помощью РНК-интерференции (RNAi). Результаты указывают на то, что они могут модулировать активность всего комплекса посредством различных механизмов в разных участках. В дальнейших исследованиях на дрозофилах было показано, что Cdk16 и cdk23 активируются посредством фосфорилирования полоподобной киназой 1 (Plk1) и ее гомологом в дрожжах *Schizosaccharomyces pombe*, которые особенно сильно связываются с Cdc23. Комплекс регулируется активаторами CDC20 и Cdh1 во время митоза. Их роль в деградации циклина B была продемонстрирована при анализе мутантов *Saccharomyces cerevisiae* с дефектами в деградации циклина B, у которых были обнаружены мутации в генах *CDC16* и *CDC23*. Мутации в генах *CDC27*, *CDC23* и *CDC16* приводили к остановке клеточного цикла на стадии метафазы.

Опознание субстрата

Субстраты APC/C содержат распознающие аминокислотные последовательности, позволяющие APC/C их идентифицировать. Наиболее распространенная последовательность известна как «коробка разрушения» или D-коробка. APC/C объединяет E2-убиквитин-конъюгирующий фермент и D-коробку, не являясь при этом промежуточным ковалентным носителем. D-коробка должна содержать вариант следующей аминокислотной последовательности: RXXLXXXXN, где R – аргинин, X – любая аминокислота, L – лейцин, а N – аспарагин. Кен-коробка – еще один важный мотив. Ее последовательность должна быть похожа на следующую: KENXXXN, где K – лизин, а E – глутамат. Последняя аминокислотная позиция в Кен-коробке сильно варьируется. Хотя было показано, что мутации в этих последовательностях действительно ингибируют разрушение белков *in vivo*, о том, как белки становятся мишенями для APC/C, еще многое предстоит узнать. Многие субстраты APC содержат как D-, так и Кен-коробки, причем их убиквитинирование осуществляется либо APC/CCdc20, либо APC/CCdh1 в зависимости от обеих последовательностей, однако некоторые субстраты содержат только D-коробку или Кен-коробку, в одной или нескольких копиях. Наличие двух различных последовательностей деградации обеспечивает высокую специфичность субстрата для APC/C, при этом APC/CCdc20 больше зависит от D-коробки, а APC/CCdh1 – от Кен-коробки. Например, APC/CCdh1 способен убиквитинировать субстраты, содержащие только Кен-коробку, такие как Tome 1 и Sororin. На основании этих ранних наблюдений было подтверждено, что в G2 и ранней митозе Emi1 связывается и ингибирует Cdc20, предотвращая его взаимодействие с субстратами APC. Cdc20 все еще может быть фосфорилирован и связываться с APC/C, но связанный Emi1 блокирует взаимодействие Cdc20 с мишенями APC. Разрушение Emi1 приводит к активации APC/CCdc20, что позволяет разрушить циклин А в ранней митозе. Уровень Emi1 начинает снова повышаться в G, что способствует ингибированию APC/CCdh1. Регулирование активности APC/CCdc20 в отношении метафазных субстратов, таких как секурин и циклин B, может быть связано с внутриклеточной локализацией. Предполагается, что белки контрольной точки веретена деления, ингибирующие APC/CCdc20, ассоциируются только с подмножеством популяции Cdc20, локализованной вблизи митотического веретена. Таким образом, циклин А может быть разрушен, в то время как циклин B и секурин разрушаются только после того, как сестринские хроматиды достигнут биориентации.