Введение
Репликация ДНК
Синтез ДНК — это естественное или искусственное создание молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК — это макромолекула, состоящая из нуклеотидных единиц, связанных ковалентными и водородными связями в повторяющейся структуре. Синтез ДНК происходит при соединении этих нуклеотидных единиц для образования ДНК; это может происходить искусственно (in vitro) или естественным путем (in vivo). Нуклеотидные единицы состоят из азотистого основания (цитозин, гуанин, аденин или тимин), пентозного сахара (дезоксирибоза) и фосфатной группы. Каждая единица соединяется при образовании ковалентной связи между ее фосфатной группой и пентозным сахаром следующего нуклеотида, формируя фосфодиэфирный остов. ДНК имеет комплементарную, двухцепочечную структуру, поскольку специфическое спаривание оснований (аденин и тимин, гуанин и цитозин) происходит естественным образом при образовании водородных связей между нуклеотидными основаниями. Существует несколько различных определений синтеза ДНК: он может относиться к репликации ДНК, биосинтезу ДНК (усиление ДНК in vivo), полимеразной цепной реакции (усиление ДНК in vitro) или синтезу генов — физическому созданию искусственных генных последовательностей. Несмотря на то, что каждый тип синтеза сильно отличается, они имеют некоторые общие черты. Нуклеотиды, соединенные в полинуклеотиды, могут служить матрицей ДНК для одной из форм синтеза ДНК — ПЦР. Репликация ДНК также использует матрицу ДНК, при этом двойная спираль ДНК раскручивается во время репликации, обнажая непоспаренные основания для образования водородных связей с новыми нуклеотидами. Однако синтез генов не требует матрицы ДНК, и гены собираются de novo. Синтез ДНК происходит у всех эукариот и прокариот, а также у некоторых вирусов. Точный синтез ДНК важен для предотвращения мутаций. У людей мутации могут приводить к таким заболеваниям, как рак, поэтому синтез ДНК и механизмы, связанные с ним in vivo, интенсивно изучались на протяжении десятилетий. В будущем эти исследования могут быть использованы для разработки технологий, связанных с синтезом ДНК, для использования в хранении данных.
Репликация ДНК
В природе молекулы ДНК синтезируются всеми живыми клетками посредством процесса репликации ДНК. Обычно это происходит как часть клеточного деления. Репликация ДНК происходит таким образом, что во время деления клетки каждая дочерняя клетка содержит точную копию генетического материала. In vivo синтез ДНК (репликация ДНК) зависит от сложного набора ферментов, которые эволюционировали для согласованной работы в S-фазе клеточного цикла. Как у эукариотов, так и у прокариотов, репликация ДНК начинается, когда специфические топоизомеразы, геликазы и гиразы (белки-инициаторы репликации) раскручивают двойную спираль ДНК, обнажая азотистые основания. Эти ферменты, вместе с дополнительными белками, формируют макромолекулярный комплекс, обеспечивающий точное дублирование последовательностей ДНК. Происходит комплементарное спаривание оснований, формируя новую двухцепочечную молекулу ДНК. Это известно как полуконсервативная репликация, поскольку одна цепь новой молекулы ДНК происходит от "родительской" цепи. Эукариотические ферменты постоянно сталкиваются с повреждениями ДНК, которые могут нарушить репликацию. Эти повреждения проявляются в виде повреждений ДНК, возникающих спонтанно или под воздействием повреждающих агентов. Поэтому механизм репликации ДНК подвергается строгому контролю, чтобы предотвратить его остановку при обнаружении повреждений. Контроль системы репликации ДНК гарантирует, что геном реплицируется только один раз за цикл; чрезмерная репликация приводит к повреждению ДНК. Дерегуляция репликации ДНК является ключевым фактором геномной нестабильности при развитии рака. Это подчеркивает специфичность механизма синтеза ДНК in vivo. Существуют различные способы искусственного стимулирования репликации природной ДНК или создания искусственных последовательностей генов. Однако синтез ДНК in vitro может быть крайне подвержен ошибкам.
Ремонтный синтез ДНК
Поврежденная ДНК подвергается восстановлению несколькими различными ферментативными процессами, каждый из которых специализируется на устранении определенных типов повреждений. ДНК человека подвергается воздействию множества естественных факторов, вызывающих повреждения, а недостаточная эффективность восстановления связана с заболеваниями и преждевременным старением. Большинство процессов восстановления ДНК формируют одноцепочечные разрывы в ДНК на промежуточной стадии, которые затем заполняются репаративным синтезом.
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция – это метод ферментативного синтеза ДНК в лабораторных условиях, основанный на циклических повторениях нагрева и охлаждения реакционной смеси для разделения цепей ДНК и последующей ферментативной репликации ДНК. Синтез ДНК в ходе ПЦР очень похож на происходящий в живых клетках, но требует специфических реагентов и условий. В процессе ПЦР ДНК химически отделяется от белков-шаперонов, а затем нагревается, что приводит к термической денатурации (разделению) цепей ДНК. На основе исходной цепи синтезируются две новые цепи комплементарной ДНК (cDNA), которые затем могут быть разделены и использованы в качестве матрицы для дальнейших циклов ПЦР. Исходная ДНК многократно увеличивается в количестве за счет множества циклов ПЦР.
РТ-ПЦР
RT-PCR отличается от обычной ПЦР тем, что синтезирует кДНК из мРНК, а не из ДНК-шаблона. Эта методика объединяет реакцию обратной транскрипции с ПЦР-амплификацией, поскольку последовательность РНК служит шаблоном для фермента обратной транскриптазы. RT-PCR часто используется для анализа экспрессии генов в определенных типах тканей или клеток на различных стадиях развития, а также для выявления генетических заболеваний.
Синтез генов
Искусственный синтез генов – это процесс синтеза гена in vitro без использования исходных образцов ДНК в качестве матрицы. В 2010 году Дж. Крейг Вентер и его команда впервые использовали полностью синтезированную ДНК для создания самовоспроизводящегося микроорганизма, получившего название Mycoplasma laboratorium. Некоторые исследования изучают возможность ферментативного синтеза с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) – ДНК-полимеразы, не требующей матрицы. Однако этот метод пока не столь эффективен, как химический синтез, и не представлен в коммерческой продаже. С развитием технологий искусственного синтеза ДНК исследуется возможность использования её для хранения данных. Благодаря сверхвысокой плотности хранения и долгосрочной стабильности, синтетическая ДНК представляет собой перспективный вариант для хранения больших объемов информации. Хотя извлечение информации из ДНК возможно очень быстро с помощью технологий секвенирования нового поколения, de novo синтез ДНК является основным ограничивающим фактором в этом процессе. Добавление происходит всего по одному нуклеотиду за цикл, при этом каждый цикл занимает секунды, что делает общий синтез очень длительным и подверженным ошибкам. Тем не менее, при дальнейшем развитии биотехнологий, синтетическая ДНК может быть использована для хранения данных.
Синтез базовых пар
Сообщается, что могут быть синтезированы новые пары нуклеобаз, помимо АТ (аденин-тимин) и ГЦ (гуанин-цитозин). Синтетические нуклеотиды можно использовать для расширения генетического алфавита и обеспечения специфической модификации участков ДНК. Даже одна дополнительная пара оснований увеличит число аминокислот, кодируемых ДНК, с существующих 20 до потенциально 172. ДНК Хачимоджи построена из восьми нуклеотидных "букв", формирующих четыре возможных пары оснований. Таким образом, она удваивает информационную плотность естественной ДНК. В исследованиях даже была получена РНК из ДНК Хачимоджи. Эта технология также может быть использована для хранения данных в ДНК.