Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Медицинское устройство, используемое для подсчета клеток.
Medical device used to count cells
Гемоцитометр (или гемоцитометр) – это счетная камера, изначально разработанная и обычно используемая для подсчета клеток крови. Гемоцитометр был изобретен Луи Чарльзом Малассесом и состоит из толстого стеклянного предметного стекла с прямоугольным углублением, создающим прецизионную объемную камеру. Эта камера имеет гравировку в виде лазерной сетки перпендикулярных линий. Устройство тщательно изготовлено таким образом, чтобы площадь, ограниченная линиями, и глубина камеры были точно известны. Наблюдая за определенной областью сетки, можно подсчитать количество клеток или частиц в определенном объеме жидкости и, следовательно, рассчитать общую концентрацию клеток в жидкости. Широко используемым типом гемоцитометра является счетная камера Нойбауэра. Для различных применений используются и другие типы гемоцитометров с различными разметками. Разметка Фукса-Розенталя обычно используется для подсчета клеток в спинномозговой жидкости, разметка Говарда-Молда – для подсчета плесени на пищевых продуктах и упаковке, разметка McMaster Egg Slide – для подсчета яиц микроорганизмов в фекалиях, разметка камеры Нажотта – для подсчета низких концентраций лейкоцитов в компонентах тромбоцитарной массы, разметка Палмера Nanoplankton – для подсчета мелкого планктона. Счетчик Петрова-Хаузера с улучшенной разметкой Нойбауэра используется для подсчета бактерий или сперматозоидов и предлагается с камерами различной глубины. Разметка Sedgwick Rafter Cell в гемоцитометре предназначена главным образом для микроскопии питьевой воды.
The hemocytometer (or haemocytometer) is a counting chamber device originally designed and usually used for counting blood cells. The hemocytometer was invented by Louis Charles Malassez and consists of a thick glass microscope slide with a rectangular indentation that creates a precision volume chamber. This chamber is engraved with a laser etched grid of perpendicular lines. The device is carefully crafted so that the area bounded by the lines is known, and the depth of the chamber is also known. By observing a defined area of the grid, it is therefore possible to count the number of cells or particles in a specific volume of fluid, and thereby calculate the concentration of cells in the fluid overall. A well used type of hemocytometer is the Neubauer counting chamber. Other types of hemocytometers with different rulings are in use for different applications. Fuchs Rosenthal rulings, commonly used for spinal fluid counting, Howard Mold rulings used for mold on food and food packaging products, McMaster Egg Slide ruling used for counting microbial eggs in fecal material, Nageotte Chamber ruling for counting low levels of white cells in white cell reduced platelet components, Palmer Nanoplankton ruling for counting smaller plankters. Petroff Hausser counter using Improved Neubauer rulings is used for bacteria or sperm counts, and is offered with varying chamber depths. The Sedgwick Rafter Cell ruling in a hemocytometer is primarily designed for use in the microscopy of drinking water.
Принципы
Решетка усовершенствованного гемоцитометра по Нойбауэру состоит из девяти квадратов размером 1 x 1 мм (1 мм²). Эти квадраты подразделены в трех направлениях: 0,25 x 0,25 мм (0,0625 мм²), 0,25 x 0,20 мм (0,05 мм²) и 0,20 x 0,20 мм (0,04 мм²). Центральный квадрат дополнительно подразделен на квадраты размером 0,05 x 0,05 мм (0,0025 мм²). Приподнятые края гемоцитометра удерживают покровное стекло на расстоянии 0,1 мм от размеченной сетки, обеспечивая каждому квадрату определенный объем (см. рисунок справа).
The gridded area of the Improved Neubauer ruled hemocytometer consists of nine 1 x 1 mm (1 mm2) squares. These are subdivided in three directions; 0.25 x 0.25 mm (0.0625 mm2), 0.25 x 0.20 mm (0.05 mm2) and 0.20 x 0.20 mm (0.04 mm2). The central square is further subdivided into 0.05 x 0.05 mm (0.0025 mm2) squares. The raised edges of the hemocytometer hold the coverslip 0.1 mm off the marked grid, giving each square a defined volume (see figure on the right). DimensionsAreaVolume at 0.1 mm depth 1 x 1 mm 1 mm2 100 nL 0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm2 6.25 nL0.25 x 0.20 mm0.05 mm25 nL 0.20 x 0.20 mm 0.04 mm2 4 nL 0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm2 0.25 nL
РазмерыПлощадьОбъем при глубине 0,1 мм
1 x 1 мм 1 мм² 100 нл
0,25 x 0,25 мм 0,0625 мм² 6,25 нл
0,25 x 0,20 мм 0,05 мм² 5 нл
0,20 x 0,20 мм 0,04 мм² 4 нл
0,05 x 0,05 мм 0,0025 мм² 0,25 нл
The gridded area of the Improved Neubauer ruled hemocytometer consists of nine 1 x 1 mm (1 mm2) squares. These are subdivided in three directions; 0.25 x 0.25 mm (0.0625 mm2), 0.25 x 0.20 mm (0.05 mm2) and 0.20 x 0.20 mm (0.04 mm2). The central square is further subdivided into 0.05 x 0.05 mm (0.0025 mm2) squares. The raised edges of the hemocytometer hold the coverslip 0.1 mm off the marked grid, giving each square a defined volume (see figure on the right). DimensionsAreaVolume at 0.1 mm depth 1 x 1 mm 1 mm2 100 nL 0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm2 6.25 nL0.25 x 0.20 mm0.05 mm25 nL 0.20 x 0.20 mm 0.04 mm2 4 nL 0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm2 0.25 nL
Использование
Для использования гемоцитометра сначала убедитесь, что специальное покровное стекло, поставляемое вместе со счётной камерой, правильно расположено на поверхности счётной камеры. Когда две стеклянные поверхности находятся в правильном контакте, можно наблюдать кольца Ньютона. Если это так, суспензию клеток наносят на край покровного стекла, чтобы она капиллярным действием заполнила пространство внутри камеры, полностью заполнив её образцом. Количество клеток в камере можно определить прямым подсчётом под микроскопом, а визуально различимые клетки можно подсчитать дифференциально. Количество клеток в камере используется для расчёта концентрации или плотности клеток в исходной смеси. Это число клеток в камере, делённое на объём камеры, который известен заранее, с учётом любых разведений и упрощений подсчёта:
To use the hemocytometer, first make sure that the special coverslip provided with the counting chamber is properly positioned on the surface of the counting chamber. When the two glass surfaces are in proper contact Newton's rings can be observed. If so, the cell suspension is applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action which completely fills the chamber with the sample. The number of cells in the chamber can be determined by direct counting using a microscope, and visually distinguishable cells can be differentially counted. The number of cells in the chamber is used to calculate the concentration or density of the cells in the mixture the sample comes from. It is the number of cells in the chamber divided by the chamber's volume, which is known from the start, taking account of any dilutions and counting shortcuts:
где объём разбавленного образца (после разведения), делённый на объём исходной смеси в образце (до разведения), является коэффициентом разведения. Например, если объём исходной смеси составлял 20 мкл и она была разбавлена один раз (путем добавления 20 мкл разбавителя), то второй член в скобках равен 40 мкл/20 мкл. Объём подсчитанных квадратов указан в таблице вверху, в зависимости от размера (см. рисунок справа). Количество подсчитанных клеток – это сумма всех клеток, подсчитанных по квадратам в одной камере. Пропорция подсчитанных клеток применяется, если не все внутренние квадраты в пределах заданного квадрата подсчитываются (т.е., если подсчитываются только 4 из 20 в угловом квадрате, то этот член будет равен 0,2). При подсчёте больших квадратов объёмом 100 нанолитров (нл) умножение на 10000 даёт желаемое количество клеток на миллилитр. Для большинства применений используются только четыре больших угловых квадрата. Клетки, находящиеся на верхней и левой линиях или касающиеся их, подсчитываются, а клетки, находящиеся на правой или нижней линиях или касающиеся их, игнорируются.
where the volume of the diluted sample (after dilution) divided by the volume of the original mixture in the sample (before dilution) is the dilution factor. For example, if the volume of the original mixture was 20μL and it was diluted once (by adding 20μL dilutant), then the second term in parentheses is 40μL/20μL. The volume of the squares counted is the one shown in the table at the top, depending on the size (see figure on the right). The number of cells counted is the sum of all cells counted across squares in one chamber. The proportion of the cells counted applies if not all inner squares within a set square are counted (i. e., if only 4 out of the 20 in a corner square are counted, then this term will equal 0.2). When counting large squares with a volume of 100 nanoliter (nL), a multiplication by 10000 leads to the desired cell count per milliliter. For most applications, the four large corner squares are only used. The cells that are on or touching the top and left lines are counted, but the ones on or touching the right or bottom lines are ignored.
Требования
Прежде чем брать образец, исходную суспензию необходимо тщательно перемешать. Это обеспечит репрезентативность образца, исключая возможность того, что он является лишь артефактом конкретной области исходной смеси, из которой он был взят. Необходимо использовать соответствующее разведение смеси, учитывающее количество клеток, подлежащих подсчету. Если образец недостаточно разведен, клетки будут слишком плотно расположены и их будет трудно подсчитать. Если же образец слишком разведен, объем образца будет недостаточен для получения достоверных выводов о концентрации в исходной смеси. Для повышения надежности результатов рекомендуется провести повторный тест на второй камере и сравнить полученные данные. Если разница между результатами превышает удвоенную погрешность подсчета (квадратный корень из количества подсчитанных клеток), метод отбора пробы может быть ненадежным (например, исходная смесь недостаточно тщательно перемешана). Камеру для подсчета следует заполнять за счет капиллярного действия после установки крышки (специального покровного стекла с сертифицированной толщиной и плоскостностью). Это позволяет избежать риска оседания или прилипания клеток к стеклу, а также испарения жидкости до установки покровного стекла, что может привести к завышению концентрации клеток. Оседание менее актуально для бактерий, однако испарение, особенно распространенное в лабораториях с кондиционированным воздухом и низкой влажностью, необходимо минимизировать.
The original suspension must be mixed thoroughly before taking a sample. This ensures the sample is representative, and not just an artifact of the particular region of the original mixture it was drawn from. An appropriate dilution of the mixture with regard to the number of cells to be counted should be used. If the sample is not diluted enough, the cells will be too crowded and difficult to count. If it is too dilute, the sample size will not be enough to make strong inferences about the concentration in the original mixture. By performing a redundant test on a second chamber, the results can be compared. If they differ more than 2 times the counting error (square root of the count), the method of taking the sample may be unreliable (e. g., the original mixture is not mixed thoroughly). The counting chamber should be filled by capillary action after the chamber lid (special cover slip with certified thickness and flatness) has been put in place. This avoids the risk that the cells could sediment/stick to the glass or some volume to evaporate before the cover slip is placed on top and resulting in an overestimation of the cell concentration. Sedimentation is less of a problem with bacteria but evaporation, more prevalent in low humidity air conditioned laboratories, still has to be minimized.