Введение

Фермент, участвующий в регуляции метаболизма углеводов.

Глюкокиназа – это фермент, облегчающий фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфат. Глюкокиназа содержится в клетках печени и поджелудочной железы человека и большинства других позвоночных. В каждом из этих органов она играет важную роль в регуляции углеводного обмена, действуя как сенсор глюкозы, вызывая изменения в метаболизме или функции клеток в ответ на повышение или понижение уровня глюкозы, например, после приема пищи или во время голодания. Мутации гена, кодирующего этот фермент, могут приводить к необычным формам диабета или гипогликемии. Глюкокиназа (GK) является изоформой гексокиназы, гомологичной как минимум трем другим гексокиназам. Все гексокиназы способны катализировать фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфат (G6P), что является первой стадией как синтеза гликогена, так и гликолиза. Однако глюкокиназа кодируется отдельным геном, и ее специфические кинетические свойства позволяют ей выполнять иной набор функций. Глюкокиназа имеет более низкое сродство к глюкозе, чем другие гексокиназы, и ее активность локализована в ограниченном числе типов клеток, в то время как остальные три гексокиназы играют более важную роль в подготовке глюкозы для гликолиза и синтеза гликогена в большинстве тканей и органов. В силу этого сниженного сродства, активность глюкокиназы при обычных физиологических условиях значительно варьируется в зависимости от концентрации глюкозы.

Номенклатура

Альтернативные названия этого фермента: гексокиназа IV человека, гексокиназа D и АТФ:D-гексозо-6-фосфотрансфераза, EC 2.7.1.1 (ранее 2.7.1.2). Распространенное название, глюкокиназа, происходит от ее относительной специфичности к глюкозе в физиологических условиях. Некоторые биохимики утверждают, что название глюкокиназа следует отменить как вводящее в заблуждение, поскольку этот фермент способен фосфорилировать и другие гексозы при определенных условиях, а в бактериях существуют отдаленно родственные ферменты с более абсолютной специфичностью к глюкозе, которые в большей степени заслуживают этого названия и кода EC 2.7.1.2. Тем не менее, глюкокиназа остается предпочтительным названием в медицине и физиологии млекопитающих. В 2004 году была обнаружена еще одна глюкозокиназа млекопитающих – глюкокиназа, специфичная к АДФ. Ее ген отличается и одновременно имеет сходство с генами примитивных организмов. Она зависима от АДФ, а не от АТФ (что указывает на потенциальную возможность более эффективной работы в условиях гипоксии), а ее метаболическая роль и значимость еще предстоит выяснить.

Субстраты и продукты

Основным субстратом, имеющим физиологическое значение для глюкокиназы, является глюкоза, а наиболее важным продуктом – глюкоза-6-фосфат (G6P). Другим необходимым субстратом, являющимся источником фосфата, является аденозинтрифосфат (АТФ), который превращается в аденозиндифосфат (АДФ) при отщеплении фосфата. Реакция, катализируемая глюкокиназой, выглядит следующим образом:

АТФ участвует в реакции в комплексе с магнием (Mg) в качестве кофактора. Кроме того, при определенных условиях глюкокиназа, подобно другим гексокиназам, может индуцировать фосфорилирование других гексоз (шестиуглеродных сахаров) и сходных молекул. Следовательно, общая реакция глюкокиназы более точно описывается как:

Кинетическая

Два важных кинетических свойства отличают глюкокиназу от других гексокиназ, позволяя ей выполнять особую роль сенсора глюкозы. Глюкокиназа имеет более низкое сродство к глюкозе, чем другие гексокиназы. Глюкокиназа изменяет конформацию и/или функцию параллельно с повышением концентрации глюкозы в физиологически важном диапазоне 4–10 ммоль/л (72–180 мг/дл). Она полунасыщена при концентрации глюкозы около 8 ммоль/л (144 мг/дл). Глюкокиназа не ингибируется своим продуктом, глюкозо-6-фосфатом. Из-за этой кооперативности кинетическое взаимодействие глюкокиназы с глюкозой не следует классической кинетике Михаэлиса-Ментен. Вместо Km для глюкозы точнее описать уровень полунасыщенности S0.5, который представляет собой концентрацию, при которой фермент насыщен и активен на 50%. Значения S0.5 и nH экстраполируются к "точке перегиба" кривой, описывающей активность фермента как функцию концентрации глюкозы, примерно при 4 ммоль/л. Иными словами, при концентрации глюкозы около 72 мг/дл, что близко к нижнему пределу нормального диапазона, активность глюкокиназы наиболее чувствительна к небольшим изменениям концентрации глюкозы. Кинетические взаимосвязи с другим субстратом, MgATP, могут быть описаны классической кинетикой Михаэлиса-Ментен, со сродством около 0,3–0,4 ммоль/л, что значительно ниже типичной внутриклеточной концентрации 2,5 ммоль/л. Тот факт, что АТФ почти всегда присутствует в избытке, подразумевает, что концентрация АТФ редко влияет на активность глюкокиназы. Максимальная специфическая активность (kcat, также известная как скорость оборота) глюкокиназы при насыщении обоими субстратами составляет 62/с. На основе вышеуказанной кинетической информации была разработана "минимальная математическая модель" для прогнозирования скорости фосфорилирования глюкозы бета-клетками (BGPR) нормальной ("дикого типа") глюкокиназы и известных мутаций. BGPR для глюкокиназы дикого типа составляет около 28% при концентрации глюкозы 5 ммоль/л, что указывает на то, что фермент работает на 28% от своей максимальной мощности при обычном пороговом значении глюкозы для запуска высвобождения инсулина.

Механизм

Сульфгидрильные группы нескольких цистеинов окружают участок связывания глюкозы. Все, кроме cys 230, необходимы для каталитического процесса, формируя множественные дисульфидные связи при взаимодействии с субстратами и регуляторами. По крайней мере, в бета-клетках, соотношение активных и неактивных молекул глюкокиназы определяется как минимум частично балансом окисления сульфгидрильных групп или восстановлением дисульфидных связей. Эти сульфгидрильные группы весьма чувствительны к окислительному статусу клеток, что делает глюкокиназу одним из наиболее уязвимых компонентов к окислительному стрессу, особенно в бета-клетках.

Структура

Глюкокиназа — мономерный белок, состоящий из 465 аминокислот и имеющий молекулярную массу около 50 кД. В его структуре присутствуют как минимум два углубления: одно для активного центра, связывающего глюкозу и MgATP, а другое — для предполагаемого аллостерического активатора, который пока не идентифицирован. Размер глюкокиназы примерно вдвое меньше, чем у других гексокиназ млекопитающих, которые сохраняют некоторую степень димерной структуры. Ряд аминокислотных последовательностей и трехмерная структура ключевых активных центров высоко консервативны как у внутривидовых гомологов, так и у различных видов, от млекопитающих до дрожжей. Например, домен связывания АТФ общий для гексокиназ, бактериальных глюкокиназ и других белков, а общая структура называется актин-складкой.

Распределение среди видов

Глюкокиназа печени широко, но не повсеместно встречается у видов позвоночных. Структура гена и аминокислотная последовательность высоко консервативны у большинства млекопитающих (например, глюкокиназа крысы и человека гомологичны более чем на 80%). Однако существуют некоторые необычные исключения: например, она не обнаружена у кошек и летучих мышей, хотя присутствует у некоторых рептилий, птиц, земноводных и рыб. Пока не установлено, встречается ли глюкокиназа аналогичным образом в поджелудочной железе и других органах. Выдвинуто предположение, что наличие глюкокиназы в печени отражает легкость, с которой углеводы могут включаться в рацион животных.

Функции и регулирование

Большая часть глюкокиназы у млекопитающих содержится в печени, и глюкокиназа обеспечивает приблизительно 95% активности гексокиназы в гепатоцитах. Фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфат (G6P) глюкокиназой является первым этапом как синтеза гликогена, так и гликолиза в печени. При достаточном количестве глюкозы синтез гликогена происходит на периферии гепатоцитов до тех пор, пока клетки не будут насыщены гликогеном. Избыток глюкозы затем все больше превращается в триглицериды для экспорта и хранения в жировой ткани. Активность глюкокиназы в цитоплазме повышается и снижается в зависимости от доступности глюкозы. G6P, продукт глюкокиназы, является основным субстратом синтеза гликогена, и глюкокиназа тесно функционально и регуляторно связана с синтезом гликогена. В состоянии максимальной активности GK и гликогенсинтаза, по-видимому, локализуются в одних и тех же периферических областях цитоплазмы гепатоцитов, где происходит синтез гликогена. Поступление G6P влияет на скорость синтеза гликогена не только как первичный субстрат, но и посредством прямой стимуляции гликогенсинтазы и ингибирования гликогенфосфорилазы. Активность глюкокиназы может быстро усиливаться или ослабляться в ответ на изменения поступления глюкозы, обычно связанные с приемом пищи и голоданием. Регуляция происходит на нескольких уровнях и с разной скоростью и зависит от множества факторов, влияющих главным образом на два общих механизма: активность глюкокиназы может быть усилена или снижена в течение нескольких минут под действием регуляторного белка глюкокиназы (GKRP). На действие этого белка влияют малые молекулы, такие как глюкоза и фруктоза. Количество глюкокиназы может быть увеличено за счет синтеза нового белка. Инсулин является основным сигналом для усиления транскрипции, действуя главным образом через транскрипционный фактор, называемый стерол-регуляторным элементом связывающего белка 1c (SREBP1c) в печени. Это происходит в течение часа после повышения уровня инсулина, например, после приема пищи, богатой углеводами.

Гормональные и диетические

Инсулин является наиболее важным из гормонов, оказывающих прямое или косвенное влияние на экспрессию и активность глюкокиназы в печени. Инсулин, по-видимому, влияет как на транскрипцию, так и на активность глюкокиназы посредством множества прямых и косвенных путей. В то время как повышение уровня глюкозы в воротной вене увеличивает активность глюкокиназы, одновременное повышение уровня инсулина усиливает этот эффект, индуцируя синтез глюкокиназы. Транскрипция глюкокиназы начинает повышаться в течение часа после повышения уровня инсулина. Транскрипция глюкокиназы становится практически неопределяемой при продолжительном голодании, выраженном дефиците углеводов или нелеченном инсулинодефицитном диабете. Механизмы, посредством которых инсулин индуцирует глюкокиназу, могут включать оба основных внутриклеточных пути действия инсулина: каскад внеклеточной сигнальной регулируемой киназы (ERK 1/2) и каскад фосфоинозитид-3-киназы (PI3K). Последний может функционировать через трансактиватор FOXO1. Однако, как и следовало ожидать, учитывая его антагонистическое действие на синтез гликогена, глюкагон и его внутриклеточный вторичный мессенджер цАМФ подавляют транскрипцию и активность глюкокиназы даже в присутствии инсулина. Другие гормоны, такие как трийодтиронин и глюкокортикоиды, в определенных обстоятельствах оказывают разрешающее или стимулирующее действие на глюкокиназу. Биотин и ретиноевая кислота повышают транскрипцию мРНК GCK, а также активность GK. Жирные кислоты в значительных количествах усиливают активность GK в печени, в то время как длинноцепочечные ацил-КоА ингибируют ее.

Печеночная

Глюкокиназа может быть быстро активирована и инактивирована в гепатоцитах новым регуляторным белком (глюкокиназный регуляторный белок), который поддерживает неактивный резерв ГК, способный быстро стать доступным в ответ на повышение уровня глюкозы в воротной вене. GKRP перемещается между ядром и цитоплазмой гепатоцитов и может быть связан с микрофиламентным цитоскелетом. Он образует обратимые комплексы 1:1 с ГК и способен перемещать его из цитоплазмы в ядро. Он действует как конкурентный ингибитор глюкозы, снижая активность фермента почти до нуля при связывании. Комплексы ГК:GKRP секвестрируются в ядре при низких уровнях глюкозы и фруктозы. Ядерная секвестрация может защищать ГК от деградации цитоплазматическими протеазами. ГК может быстро высвобождаться из GKRP в ответ на повышение уровня глюкозы. В отличие от ГК в бета-клетках, ГК в гепатоцитах не связан с митохондриями. Фруктоза в незначительных (микромолярных) количествах (после фосфорилирования кетогексокиназой до фруктозо-1-фосфата (F1P)) ускоряет высвобождение ГК из GKRP. Эта чувствительность к небольшим количествам фруктозы позволяет GKRP, ГК и кетогексокиназе функционировать как "система определения фруктозы", сигнализирующая о переваривании смешанной углеводной пищи и ускоряющей утилизацию глюкозы. Однако фруктозо-6-фосфат (F6P) усиливает связывание ГК с GKRP. F6P снижает фосфорилирование глюкозы ГК при гликогенолизе или глюконеогенезе. F1P и F6P связываются с одним и тем же участком на GKRP. Предполагается, что они индуцируют две различные конформации GKRP, одна из которых способна связывать ГК, а другая – нет.

Панкреатическая

Хотя основная часть глюкокиназы в организме локализуется в печени, меньшие количества в бета- и альфа-клетках поджелудочной железы, определенных гипоталамусных нейронах и специфических клетках (энтероцитах) кишечника играют все более значимую роль в регуляции углеводного обмена. В контексте функции глюкокиназы эти типы клеток объединяются термином «нейроэндокринные ткани», и они имеют общие черты в регуляции и функционировании глюкокиназы, особенно общий нейроэндокринный промотор. Среди нейроэндокринных клеток наиболее изучены и хорошо поняты бета-клетки островков поджелудочной железы. Вероятно, многие регуляторные взаимосвязи, выявленные в бета-клетках, будут существовать и в других нейроэндокринных тканях, содержащих глюкокиназу.

Сигнал для инсулина

В бета-клетках островков поджелудочной железы активность глюкокиназы является ключевым регулятором секреции инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. По мере потребления G6P, возрастающее количество АТФ запускает каскад процессов, приводящих к высвобождению инсулина. Одним из непосредственных последствий усиления клеточного дыхания является повышение концентраций NADH и NADPH (вместе обозначаемых как NAD(P)H). Это изменение окислительно-восстановительного статуса бета-клеток приводит к увеличению внутриклеточного уровня кальция, закрытию KATP-каналов, деполяризации клеточной мембраны, слиянию инсулинсодержащих секреторных гранул с мембраной и высвобождению инсулина в кровь. Именно как сигнал для высвобождения инсулина глюкокиназа оказывает наибольшее влияние на уровень глюкозы в крови и общее направление углеводного обмена. Глюкоза, в свою очередь, влияет как на немедленную активность, так и на количество глюкокиназы, производимой в бета-клетках.

Регулирование в бета-клетках

Глюкоза немедленно усиливает активность глюкокиназы благодаря эффекту кооперативности. Второй важный быстрый регулятор активности глюкокиназы в бета-клетках – прямое белок-белковое взаимодействие глюкокиназы и "бифункционального фермента" (фосфофруктокиназы 2/фруктозы 2,6-бисфосфатазы), который также участвует в регуляции гликолиза. Эта физическая ассоциация стабилизирует глюкокиназу в каталитически благоприятной конформации (в некоторой степени противоположной эффекту связывания с GKRP), что повышает ее активность. Уже через 15 минут глюкоза может стимулировать транскрипцию ГКК и синтез глюкокиназы посредством инсулина. Инсулин продуцируется бета-клетками, но часть его действует на бета-клеточные инсулиновые рецепторы типа B, обеспечивая аутокринную положительную обратную связь, усиливающую активность глюкокиназы. Дальнейшее усиление происходит за счет действия инсулина (через рецепторы типа A) для стимуляции собственной транскрипции. Транскрипция гена GCK инициируется с помощью "верхнего" или нейроэндокринного промотора. Этот промотор, в отличие от промотора печени, содержит элементы, гомологичные промоторам других генов, индуцируемых инсулином. Среди вероятных транзакционных факторов – Pdx 1 и PPARγ. Pdx 1 – это гомеодоменный транскрипционный фактор, участвующий в дифференцировке поджелудочной железы. PPARγ – это ядерный рецептор, который реагирует на препараты глитазонов, повышая чувствительность к инсулину.

Связь с инсулиносекреторными гранулами

Большая часть, но не вся, глюкокиназы, обнаруженной в цитоплазме бета-клеток, связана с секреторными гранулами инсулина и с митохондриями. Доля глюкокиназы, находящейся в таком "связанном" состоянии, быстро уменьшается в ответ на повышение концентрации глюкозы и секреции инсулина. Предполагается, что такое связывание выполняет функцию, аналогичную регуляторному белку глюкокиназы в печени, – защищает глюкокиназу от деградации, обеспечивая ее быструю доступность при повышении уровня глюкозы. Это позволяет усилить реакцию глюкокиназы на глюкозу быстрее, чем это было бы возможно посредством транскрипции.

Супрессия глюкагона в альфа-клетках

Также было предложено, что глюкокиназа играет роль в восприятии глюкозы альфа-клетками поджелудочной железы, однако доказательства менее убедительны, и некоторые исследователи не обнаружили активности глюкокиназы в этих клетках. Альфа-клетки находятся в островках поджелудочной железы, перемежаясь с бета-клетками и другими клетками. В то время как бета-клетки реагируют на повышение уровня глюкозы секрецией инсулина, альфа-клетки отвечают снижением секреции глюкагона. При падении концентрации глюкозы в крови до гипогликемического уровня альфа-клетки высвобождают глюкагон. Глюкагон – это белковый гормон, блокирующий действие инсулина на гепатоциты, стимулируя гликогенолиз, глюконеогенез и уменьшение активности глюкокиназы в гепатоцитах. Неясно, является ли подавление секреции глюкагона глюкозой прямым эффектом глюкозы через глюкокиназу в альфа-клетках или косвенным эффектом, опосредованным инсулином или другими сигналами от бета-клеток.

Гипоталамус

В то время как все нейроны используют глюкозу в качестве топлива, определенные глюкозочувствительные нейроны изменяют частоту возбуждения в ответ на повышение или понижение уровня глюкозы. Эти глюкозочувствительные нейроны сосредоточены главным образом в вентромедиальном ядре и дугообразном ядре гипоталамуса, которые регулируют многие аспекты гомеостаза глюкозы (особенно реакцию на гипогликемию), утилизацию топлива, насыщение и аппетит, а также поддержание веса. Эти нейроны наиболее чувствительны к изменениям глюкозы в диапазоне 0,5–3,5 ммоль/л. Глюкокиназа обнаружена в мозге в основном в тех же областях, которые содержат глюкозочувствительные нейроны, включая оба гипоталамических ядра. Ингибирование глюкокиназы устраняет реакцию вентромедиального ядра на прием пищи. Однако уровень глюкозы в мозге ниже, чем в плазме, обычно составляя 0,5–3,5 ммоль/л. Хотя этот диапазон соответствует чувствительности глюкозочувствительных нейронов, он ниже оптимальной точки инфлексии чувствительности для глюкокиназы. Предполагается, основываясь на косвенных данных и спекуляциях, что нейронная глюкокиназа каким-то образом подвергается воздействию уровня глюкозы в плазме даже внутри нейронов.

Энтероциты и инкретин

Хотя было показано, что глюкокиназа присутствует в определенных клетках (энтероцитах) тонкого кишечника и желудка, ее функция и регуляция остаются неизученными. Предполагается, что и здесь глюкокиназа выполняет роль сенсора глюкозы, позволяя этим клеткам обеспечивать один из самых ранних метаболических ответов на поступающие углеводы. Есть основания полагать, что эти клетки вовлечены в функции инкретинов.

Клиническое значение

Поскольку инсулин является одним из, если не самым важным, регуляторов синтеза глюкокиназы, сахарный диабет любого типа снижает синтез и активность глюкокиназы посредством различных механизмов. Активность глюкокиназы чувствительна к окислительному стрессу клеток, особенно бета-клеток. На данный момент обнаружено не менее 497 мутаций гена глюкокиназы человека GCK, которые могут изменять эффективность связывания и фосфорилирования глюкозы, повышая или понижая чувствительность секреции инсулина бета-клетками в ответ на глюкозу и приводя к клинически значимой гипергликемии или гипогликемии.

Сахарный диабет

Мутации GCK снижают функциональную эффективность молекулы глюкокиназы. Гетерозиготность по аллелям с пониженной активностью фермента приводит к повышению порога секреции инсулина и стойкой, умеренной гипергликемии. Это состояние известно как сахарный диабет у молодых (MODY2). Последний обзор наблюдаемых у пациентов мутаций GCK включает 791 мутацию, из которых 489 считаются вызывающими диабет MODY и, следовательно, снижающими функциональную эффективность молекулы глюкокиназы. Гомозиготность по аллелям GCK с пониженной функцией может привести к тяжелому врожденному дефициту инсулина, вызывающему стойкий неонатальный диабет.

Гиперинсулинометика гипогликемия

Было обнаружено, что некоторые мутации усиливают секрецию инсулина. Гетерозиготность по мутациям, приводящим к усилению функции, снижает порог глюкозы, запускающий высвобождение инсулина. Это может вызывать гипогликемию различного характера, включая транзиторный или стойкий врожденный гиперинсулинизм, а также гипогликемию натощак или реактивную гипогликемию, проявляющуюся в более позднем возрасте. Последний обзор мутаций гена GCK, выявленных у пациентов, сообщает о 17 мутациях GCK, вызывающих гиперинсулиническую гипогликемию и сахарный диабет 2 типа.