Динеины: Моторные белки цитоскелета и их функции.

Введение

Класс ферментов

Динеины — это семейство цитоскелетных моторных белков, которые перемещаются вдоль микротрубочек в клетках. Они преобразуют химическую энергию, запасенную в АТФ, в механическую работу. Динеин транспортирует различные клеточные грузы, создает силы и перемещения, важные для митоза, и обеспечивает движение эукариотических ресничек и жгутиков. Все эти функции основаны на способности динеина двигаться к минусовому концу микротрубочек, что известно как ретроградный транспорт; таким образом, их называют "двигателями, направленными к минусу". В отличие от этого, большинство моторных белков кинезина движутся к плюсовому концу микротрубочек, что называется антероградным транспортом.

Функция

Аксонемальный динеин вызывает скольжение микротрубочек в аксонемах ресничек и жгутиков и встречается только в клетках, обладающих этими структурами. Цитоплазматический динеин, обнаруженный во всех животных клетках и, возможно, в растительных клетках, выполняет функции, необходимые для выживания клетки, такие как транспорт органелл и сборка центросом. Цитоплазматический динеин перемещается по микротрубочке прогрессивно; то есть, один из его стеблей всегда прикреплен к микротрубочке, позволяя динеину "пройти" значительное расстояние вдоль микротрубочки, не отсоединяясь. Цитоплазматический динеин способствует позиционированию комплекса Гольджи и других органелл в клетке. Динеин транспортирует органеллы, везикулы и, возможно, фрагменты микротрубочек вдоль аксонов нейронов к телу клетки в процессе, называемом ретроградным аксональным транспортом.

Позиционирование митотического шпинделя

Цитоплазматический динеин позиционирует веретено деления в месте цитокинеза, закрепляясь в кортексе клетки и тянув за астральные микротрубочки, исходящие из центросомы. Будучи постдоком в MIT, Томоми Кийомицу обнаружила, как динеин выполняет роль моторного белка в выравнивании хромосом в середине клетки во время метафазы митоза. Динеин тянет микротрубочки и хромосомы к одному концу клетки. Когда концы микротрубочек приближаются к клеточной мембране, они высвобождают химический сигнал, который перемещает динеин на противоположную сторону клетки. Этот процесс повторяется до тех пор, пока хромосомы не окажутся в центре клетки, что необходимо для митоза. Пивные дрожжи стали мощной модельной системой для изучения этого процесса и показали, что динеин направляется к плюс-концам астральных микротрубочек и доставляется в кортекс клетки посредством механизма высвобождения.

Вирусная репликация

Вирусы могут использовать динеин и кинезин для облегчения процесса вирусной репликации. Многие вирусы используют систему транспорта по микротрубочкам для доставки нуклеиновых кислот/белковых ядер к внутриклеточным участкам репликации после проникновения через клеточную мембрану хозяина. О специфических участках связывания вирусов с моторными белками известно немного, но известно, что некоторые вирусы содержат богатые пролином последовательности (которые различаются между вирусами), удаление которых снижает связывание с динактином, аксональный транспорт (в культуре клеток) и нейроинвазию in vivo. Это позволяет предположить, что богатые пролином последовательности могут являться основным участком связывания, задействующим динеин.

Структура

Каждая молекула динеинового мотора — это сложная белковая сборка, состоящая из множества более мелких полипептидных субъединиц. Цитоплазматический и аксонемальный динеин содержат некоторые общие компоненты, но также и уникальные субъединицы.

Цитоплазматический динеин

Цитоплазматический динеин, молекулярная масса которого составляет около 1,5 мегадалтон (МДа), представляет собой димер димеров, содержащий приблизительно двенадцать полипептидных субъединиц: две идентичные "тяжелые цепи" массой 520 кДа, которые содержат АТФазную активность и, следовательно, отвечают за генерацию движения вдоль микротрубочки; две промежуточные цепи 74 кДа, которые, как считается, закрепляют динеин к его грузу; две легкие промежуточные цепи 53–59 кДа; и несколько легких цепей. АТФазная активность, генерирующая силу, каждой тяжелой цепи динеина локализована в ее большой "головке" в форме пончика, которая связана с другими AAA-белками, в то время как две проекции от головки соединяют ее с другими цитоплазматическими структурами. Одна проекция, спиральный стебель, связывается и "проходит" по поверхности микротрубочки посредством повторяющегося цикла отсоединения и повторного присоединения. Другая проекция, удлиненный хвост, связывается с легкими промежуточными, промежуточными и легкими цепями субъединиц, которые присоединяют динеин к его грузу. Чередующаяся активность парных тяжелых цепей в полном цитоплазматическом динеиновом моторе позволяет одной молекуле динеина транспортировать свой груз, "проходя" значительное расстояние вдоль микротрубочки, не отсоединяясь полностью. В апо-состоянии динеина мотор не связан с нуклеотидами, кольцо AAA-домена находится в открытой конформации, а MTBD находится в состоянии высокой аффинности. Многие аспекты AAA-доменов остаются неизвестными, но AAA1 хорошо установлен как основной сайт гидролиза АТФ в динеине. Когда АТФ связывается с AAA1, это инициирует конформационное изменение кольца AAA-домена в "закрытую" конфигурацию, движение подпорки. Линкер изгибается и смещается с AAA5 на AAA2, оставаясь связанным с AAA1, и искривляет стебель. После гидролиза АТФ стебель вращается, перемещая динеин дальше по МТ. После высвобождения фосфата MTBD возвращается в состояние высокой аффинности и повторно связывается с МТ, запуская рабочий ход. Линкер возвращается в прямую конформацию и переключается обратно с AAA2 на AAA5, создавая рычажный эффект, производящий наибольшее смещение динеина, достигаемое рабочим ходом. Триплексный комплекс, включающий динеин, динактин и адаптер груза, обладает ультрапроцессивностью и может проходить большие расстояния без отсоединения, чтобы достичь внутриклеточного назначения груза. Адаптеры груза, идентифицированные на данный момент, включают BicD2, Hook3, FIP3 и Spindly. Другие субъединицы хвоста также могут способствовать этому взаимодействию, о чем свидетельствует структура динеина-динактина-BicD2 с низким разрешением. Одной из основных форм регуляции мотора в клетках для динеина является динактин. Он может потребоваться практически для всех функций цитоплазматического динеина. В настоящее время это наиболее изученный партнер динеина. Динактин - это белок, который помогает в внутриклеточном транспорте по всей клетке, связываясь с цитоплазматическим динеином. Динактин может функционировать как каркас для связывания других белков. Он также функционирует как рекрутирующий фактор, который локализует динеин там, где он должен быть. Существуют также некоторые данные, свидетельствующие о том, что он может регулировать кинезин 2. Динактиновый комплекс состоит из более чем 20 субъединиц. Нет убедительных доказательств того, что динактин сам по себе влияет на скорость мотора. Однако он влияет на процессивность мотора. Регуляция связывания, вероятно, аллостерическая: эксперименты показали, что улучшения процессивности динеинового мотора не зависят от домена связывания субъединицы p150 с микротрубочками.

Cytoplasmic dynein, which has a molecular mass of about 1.5 megadaltons (MDa), is a dimer of dimers, containing approximately twelve polypeptide subunits: two identical "heavy chains", 520 kDa in mass, which contain the ATPase activity and are thus responsible for generating movement along the microtubule; two 74 kDa intermediate chains which are believed to anchor the dynein to its cargo; two 53–59 kDa light intermediate chains; and several light chains. The force generating ATPase activity of each dynein heavy chain is located in its large doughnut shaped "head", which is related to other AAA proteins, while two projections from the head connect it to other cytoplasmic structures. One projection, the coiled coil stalk, binds to and "walks" along the surface of the microtubule via a repeated cycle of detachment and reattachment. The other projection, the extended tail, binds to the light intermediate, intermediate and light chain subunits which attach dynein to its cargo. The alternating activity of the paired heavy chains in the complete cytoplasmic dynein motor enables a single dynein molecule to transport its cargo by "walking" a considerable distance along a microtubule without becoming completely detached. In the apo state of dynein, the motor is nucleotide free, the AAA domain ring exists in an open conformation, and the MTBD exists in a high affinity state. Much about the AAA domains remains unknown, but AAA1 is well established as the primary site of ATP hydrolysis in dynein. When ATP binds to AAA1, it initiates a conformational change of the AAA domain ring into the “closed” configuration, movement of the buttress, The linker becomes bent and shifts from AAA5 to AAA2 while remaining bound to AAA1. and kinking the stalk. Following hydrolysis of ATP, the stalk rotates, moving dynein further along the MT. Upon the release of the phosphate, the MTBD returns to a high affinity state and rebinds the MT, triggering the power stroke. The linker returns to a straight conformation and swings back to AAA5 from AAA2 and creates a lever action, producing the greatest displacement of dynein achieved by the power stroke The tri complex, which includes dynein, dynactin and a cargo adaptor, is ultra processive and can walk long distances without detaching in order to reach the cargo's intracellular destination. Cargo adaptors identified thus far include BicD2, Hook3, FIP3 and Spindly. The other tail subunits may also help facilitate this interaction as evidenced in a low resolution structure of dynein dynactin BicD2. One major form of motor regulation within cells for dynein is dynactin. It may be required for almost all cytoplasmic dynein functions. Currently, it is the best studied dynein partner. Dynactin is a protein that aids in intracellular transport throughout the cell by linking to cytoplasmic dynein. Dynactin can function as a scaffold for other proteins to bind to. It also functions as a recruiting factor that localizes dynein to where it should be. There is also some evidence suggesting that it may regulate kinesin 2. The dynactin complex is composed of more than 20 subunits, There is no definitive evidence that dynactin by itself affects the velocity of the motor. It does, however, affect the processivity of the motor. The binding regulation is likely allosteric: experiments have shown that the enhancements provided in the processivity of the dynein motor do not depend on the p150 subunit binding domain to the microtubules.

Аксонемальный динеин

Аксонемальные динейны представлены различными формами, содержащими одну, две или три неидентичных тяжелых цепи (в зависимости от организма и локализации в ресничке). Каждая тяжелая цепь имеет глобулярный моторный домен с дончатообразной структурой, которая, как считается, схожа со структурой других AAA-белков, спиральный "стебель", связывающийся с микротрубочкой, и удлиненный хвост (или "подушечку"), прикрепляющийся к соседней микротрубочке той же аксонемы. Таким образом, каждая молекула динеина формирует перекрестный мостик между двумя соседними микротрубочками ресничной аксонемы. Во время "рабочего хода", вызывающего движение, моторный домен AAA-АТФазы претерпевает конформационное изменение, которое приводит к повороту стебля, связывающего микротрубочки, относительно хвоста, связывающего груз, в результате чего одна микротрубочка скользит относительно другой (Karp, 2005). Это скольжение создает изгибающее движение, необходимое для биения ресничек и перемещения клетки или других частиц. Группы молекул динеина, ответственные за движение в противоположных направлениях, вероятно, активируются и инактивируются согласованно, чтобы реснички или жгутики могли двигаться вперед и назад. Радиальное лучико было предложено в качестве (или одной из) структур, синхронизирующих это движение. Регуляция активности аксонемального динеина критически важна для частоты ударов жгутиков и формы волны ресничек. Способы регуляции аксонемального динеина включают фосфорилирование, окислительно-восстановительные реакции и влияние кальция. Механические силы, действующие на аксонему, также влияют на функцию аксонемального динеина. Тяжелые цепи внутренних и внешних "рук" аксонемального динеина фосфорилируются/дефосфорилируются для контроля скорости скольжения микротрубочек. Тиоредоксины, связанные с другими "руками" аксонемального динеина, окисляются/восстанавливаются для регуляции места связывания динеина в аксонеме. Центерины и компоненты внешних "рук" аксонемального динеина обнаруживают колебания концентрации кальция. Колебания кальция играют важную роль в изменении формы волны ресничек и частоты ударов жгутиков (King, 2012).

История

Белок, ответственный за движение ресничек и жгутиков, был впервые обнаружен и назван динеином в 1963 году (Karp, 2005). Спустя 20 лет цитоплазматический динеин, существование которого предполагалось с момента открытия динеина жгутиков, был выделен и идентифицирован (Karp, 2005).

Сегрегация хромосом во время мейоза

Сегрегация гомологичных хромосом к противоположным полюсам клетки происходит во время первого деления мейоза. Правильная сегрегация необходима для образования гаплоидных мейотических продуктов с нормальным набором хромосом. Образование хиазм (событий кроссинговера) обычно облегчает правильную сегрегацию. Однако у дрожжей Schizosaccharomyces pombe, при отсутствии хиазм, динеин обеспечивает сегрегацию. Dhc1, моторный субъединичный комплекс динеина, необходим для сегрегации хромосом как при наличии, так и при отсутствии хиазм. Белок легкой цепи динеина Dlc1 также необходим для сегрегации, особенно когда хиазмы отсутствуют.