Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Семейство белковых комплексов у бактерий.
Family of protein complexes in bacteria
Функция
Как RecD, так и RecB являются геликазами, то есть энергозависимыми молекулярными двигателями, раскручивающими ДНК (или РНК в случае других белков). Подразделение RecB дополнительно обладает функцией нуклеазы. Наконец, фермент RecBCD (вероятно, субъединица RecC) распознает специфическую последовательность в ДНК, 5' GCTGGTGG 3', известную как Chi (иногда обозначаемую греческой буквой χ). RecBCD уникален среди геликаз тем, что содержит две геликазы, движущиеся с разной скоростью, и способностью распознавать и изменяться под воздействием последовательности Chi ДНК. RecBCD активно связывается с концом линейной двухцепочечной (ds) ДНК. Геликаза RecD движется по цепи с 5'-концом, с которого фермент начинает раскручивание, а RecB – по цепи с 3'-концом. RecB движется медленнее, чем RecD, поэтому перед RecB накапливается одноцепочечная (ss) петля ДНК (рисунок 2). Это приводит к образованию структур ДНК с двумя одноцепочечными "хвостами" (короткий 3'-концевой хвост и длинный 5'-концевой хвост) и одной одноцепочечной петлей (на 3'-концевой цепи), наблюдаемым с помощью электронной микроскопии. Эти одноцепочечные хвосты могут отжигать, образуя вторую петлю, комплементарную первой; подобные парные петли изначально назывались «заячьими ушами».
Both the RecD and RecB subunits are helicases, i. e., energy dependent molecular motors that unwind DNA (or RNA in the case of other proteins). The RecB subunit in addition has a nuclease function. Finally, RecBCD enzyme (perhaps the RecC subunit) recognizes a specific sequence in DNA, 5' GCTGGTGG 3', known as Chi (sometimes designated with the Greek letter χ). RecBCD is unusual amongst helicases because it has two helicases that travel with different rates and because it can recognize and be altered by the Chi DNA sequence. RecBCD avidly binds an end of linear double stranded (ds) DNA. The RecD helicase travels on the strand with a 5' end at which the enzyme initiates unwinding, and RecB on the strand with a 3' end. RecB is slower than RecD, so that a single stranded (ss) DNA loop accumulates ahead of RecB (Figure 2). This produces DNA structures with two ss tails (a shorter 3’ ended tail and a longer 5’ ended tail) and one ss loop (on the 3' ended strand) observed by electron microscopy. The ss tails can anneal to produce a second ss loop complementary to the first one; such twin loop structures were initially referred to as “rabbit ears.”
Механизм действия
При размотке нуклеаза RecB может действовать по-разному в зависимости от условий реакции, в частности от соотношения концентраций ионов Mg2+ и АТФ. (1) При избытке АТФ фермент просто вносит разрыв в цепь с Chi (цепь с исходным 3'-концом) (рисунок 2). Размотка продолжается и образует 3'-одноцепочечный хвост с Chi вблизи его конца. Этот хвост может связываться с белком RecA, который способствует обмену цепью с неповрежденной гомологичной двухцепочечной ДНК. Когда RecBCD достигает конца ДНК, все три субъединицы диссоциируют, и фермент остается неактивным в течение часа или более; молекула RecBCD, которая действовала на Chi, не атакует другую молекулу ДНК. (2) При избытке ионов Mg2+ RecBCD расщепляет обе цепи ДНК эндонуклеолитически, хотя 5'-хвост расщепляется реже (рисунок 3). Когда RecBCD встречает сайт Chi на 3'-концевой цепи, размотка приостанавливается и деградация 3'-хвоста замедляется. Когда RecBCD возобновляет размотку, он теперь расщепляет противоположную цепь (то есть 5'-хвост) и загружает белок RecA на 3'-концевую цепь. Сайт Chi на одной молекуле ДНК в клетках снижает или устраняет активность Chi на другой ДНК, возможно, отражая зависимую от Chi диссоциацию RecBCD, наблюдаемую in vitro в условиях избытка АТФ и внесения разрывов в ДНК в Chi. При обоих условиях реакции 3'-цепь остается неповрежденной ниже по течению от Chi. Затем белок RecA активно загружается на 3'-хвост ферментом RecBCD. Фермент также полезен для удаления линейной ДНК, одно- или двухцепочечной, из препаратов круговой двухцепочечной ДНК, поскольку для его активности требуется конец ДНК.
During unwinding the nuclease in RecB can act in different ways depending on the reaction conditions, notably the ratio of the concentrations of Mg2+ ions and ATP. (1) If ATP is in excess, the enzyme simply nicks the strand with Chi (the strand with the initial 3' end) (Figure 2). Unwinding continues and produces a 3' ss tail with Chi near its terminus. This tail can be bound by RecA protein, which promotes strand exchange with an intact homologous DNA duplex. When RecBCD reaches the end of the DNA, all three subunits disassemble and the enzyme remains inactive for an hour or more; a RecBCD molecule that acted at Chi does not attack another DNA molecule. (2) If Mg2+ ions are in excess, RecBCD cleaves both DNA strands endonucleolytically, although the 5' tail is cleaved less often (Figure 3). When RecBCD encounters a Chi site on the 3' ended strand, unwinding pauses and digestion of the 3' tail is reduced. When RecBCD resumes unwinding, it now cleaves the opposite strand (i. e., the 5' tail) and loads RecA protein onto the 3’ ended strand. A Chi site on one DNA molecule in cells reduces or eliminates Chi activity on another DNA, perhaps reflecting the Chi dependent disassembly of RecBCD observed in vitro under conditions of excess ATP and nicking of DNA at Chi. Under both reaction conditions, the 3' strand remains intact downstream of Chi. The RecA protein is then actively loaded onto the 3' tail by RecBCD. The enzyme is also useful in removing linear DNA, either single or double stranded, from preparations of circular double stranded DNA, since it requires a DNA end for activity.